Появление коронавируса тяжелого острого респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2) спровоцировало продолжающуюся коронавирусную болезнь 2019 года (COVID-19). И иммунологически, и биологически шиповидный белок SARS-CoV-2 представляет собой привлекательную мишень для исследователей, стремящихся противодействовать этому вирусу или нейтрализовать его.

Новое исследование, размещенное на сервере препринтов bioRxiv* , описывает псевдовирусную систему, основанную на глубоком мутационном сканировании (DMS), чтобы продемонстрировать, как известные и будущие мутации могут повлиять на способность SARS-CoV-2 избегать нейтрализации естественными и терапевтическими антителами. 

Исследование:  псевдовирусная система позволяет проводить глубокое мутационное сканирование полного шипа SARS-CoV-2. Изображение предоставлено: Design_Cells / Shutterstock.com

Введение

DMS является ценным инструментом для прогнозирования того, как тысячи различных генетических изменений в белке спайка могут влиять на поведение вируса, опосредованное эффектами на укладку белка, функцию белка и связывание антител. Как высокопроизводительный метод, DMS может генерировать большие объемы данных, которые идеально подходят для методов компьютерного моделирования для прогнозирования антигенного поведения потенциальных новых вариантов SARS-CoV-2.

До настоящего исследования DMS в основном использовался для изучения мутаций в рецептор-связывающем домене (RBD) белка шипа или небольшого количества мутаций шипа с использованием систем отображения клеточной поверхности на клетках дрожжей или млекопитающих. Однако этот подход ограничивает способность DMS точно измерять эффекты нейтрализации; поэтому оцениваются только результаты связывания антител, которые часто менее клинически значимы.

Новая платформа DMS

Главной новинкой текущей платформы является ее уникальный протокол, предназначенный для создания большого количества мутантов псевдовируса в библиотеках, где каждый генотип лентивируса связан с конкретным вариантом поверхностного шиповидного белка. Такое сцепление генотип-фенотип не характерно для подобных экспериментов.

Хотя отсутствие такой связи не представляет проблемы при использовании одного варианта вируса, в текущем эксперименте была предпринята попытка изучить тысячи вариантов. С этой целью новая платформа использовалась для картирования эффектов мутаций в различных частях RBD, N-концевого домена (NTD) и субъединицы S2 шиповидного белка на инфицирование клеток и нейтрализацию антител.

Подход, использованный в текущем исследовании, может генерировать более 10 5 единиц трансдукции (псевдовирусы, сцепленные по генотипу и фенотипу) на миллилитр, с возможным дальнейшим увеличением в пять-десять раз при правильных условиях.

Исследователи отобрали только те мутации, которые казались вероятными в ходе естественной эволюции вируса. Эти мутации были получены из базы данных Глобальной инициативы по обмену данными о птичьем гриппе (GISAID), что, вероятно, представляет собой функциональный спайковый белок.

Мутации, которые независимо появлялись несколько раз, использовались с более высокой скоростью, тогда как сайты, демонстрирующие положительный отбор, интенсивно исследовались, включая все возможные изменения в аминокислотах. Также были включены часто наблюдаемые делеции.

Платформа для глубокого мутационного сканирования спайков. (A) Основа лентивируса, используемая для глубокого мутационного сканирования. Скелет содержит функциональные лентивирусные 5′- и 3′-области длинных концевых повторов (LTR). Ген шипа находится под промотором индуцируемого элемента ответа tet 3-го поколения (TRE3G), и ниже стоп-кодона находится штрих-код из 16 нуклеотидов (BC). Промотор CMV управляет экспрессией репортерного гена ZsGreen, который связан с геном устойчивости к пуромицину (PuR) через линкер T2A. Остов также содержит посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита сурка (WPRE), элемент ответа Rev (RRE) и центральный полипуриновый тракт (cPPT). (B) Подход к созданию библиотек лентивирусов, связанных генотип-фенотип. Клетки HEK-293T трансфицировали лентивирусным остовом, несущим шипы, экспрессионной плазмидой VSV-G и лентивирусными хелперными плазмидами для получения псевдотипированных лентивирусов VSV-G. Эти вирусы используют для трансдукции обратного контролируемого тетрациклином трансактиватора (rtTA), экспрессирующего клетки HEK-293T, при низкой множественности инфекции (MOI), и успешно трансдуцированные клетки отбирают с использованием пуромицина. Выбранные клетки могут быть трансфицированы хелперными плазмидами и экспрессионной плазмидой VSV-G для получения псевдотипированных вирусов VSV-G, несущих все геномы, присутствующие в библиотеке глубоких мутаций, или выбранные клетки могут быть индуцированы доксициклином (dox) для экспрессии шипа и трансфицированы только хелперные плазмиды для создания псевдотипированных лентивирусов, которые имеют связь между генотипом и фенотипом. (C) Среднее количество мутаций на шип со штрих-кодом в библиотеках BA.1. (D) Общее количество вариантов штрих-кода в каждой библиотеке BA.1. (E) Охват предполагаемых мутаций во всех библиотеках BA.1.

Для настоящего исследования использовалась библиотека из 7000 мутаций в варианте спайка Omicron BA.1 и почти такое же количество мутаций спайка варианта Delta. Текущий метод использует две или три мутации кодона в каждом трансдуцируемом варианте спайка, что позволяет оценить эффект каждой мутации на фоне других сопутствующих мутаций.

NutriBiotic, Immunity, витамины C + D3 и цинк, 100 капсул

Каждая из этих мутаций получила свой собственный штрих-код после интеграции псевдовируса в свою конечную клетку-хозяина.

Важно отметить, что связывание штрих-кодов с вариантами спайков позволяет нам использовать короткое секвенирование штрих-кода Illumina для получения полного генотипа спайка во всех последующих экспериментах ».

С помощью протокола генотип-фенотип были созданы две и три библиотеки вариантов Delta и BA.1, содержащие по 50 000 и 100 000 вариантов соответственно. Этим библиотекам были присвоены функциональные оценки, отражающие их способность инфицировать клетку-хозяина по сравнению с вариантом родительского шипа. Несинонимичные мутации часто имели плохие оценки, особенно когда их было несколько, « отражая стоимость накопления нескольких часто умеренно вредных мутаций ».

Исследователи также добавили псевдовирус со штрих-кодом с вариантом шипа, устойчивым ко всем антителам против шипа. Это обеспечило абсолютный стандарт нейтрализации, в котором можно было сравнить изменения количества штрих-кодов псевдовируса для этого и других вариантов, чтобы рассчитать степень изменения нейтрализации для каждого варианта по сравнению с этим вариантом.

Что показало исследование?

Затем был проведен тестовый случай с использованием набора нейтрализующих антител (nAb) BA.1, нацеленных на RBD (LY-CoV1404 или бебтеловимаб), NTD (5-7) и S2 (CC67.105).

Бебтеловимаб оставался эффективным против Омикрона из-за его эпитопа RBD. В то время как некоторые мутации Omicron в сайтах ускользания в эпитопе бебтеловимаба малоэффективны, другие ускользают. Поскольку новые мутации K444 обнаруживаются в более новых подвариантах Omicron, бебтеловимаб может в конечном итоге потерять свою существующую активность.

Аналогичные результаты были получены и с двумя другими антителами, в которых были идентифицированы сайты, в которых может быть произведено полное ускользание.

Широта нейтрализации, то есть способность нейтрализовать пансарбековирусные эпитопы, не придает эффективности против SARS-CoV-2. Это связано с наличием мутаций, обнаруженных в некоторых подвариантах Омикрона, которые также позволяют полностью избежать воздействия широко нейтрализующих антител.

[Это] подчеркивает важность прямого картирования ускользающих мутаций в SARS-CoV-2 в дополнение к оценке охвата других естественных коронавирусов , связанных с SARS ».

Также изучалось влияние различных мутаций на вирусную инфекцию в отсутствие антител. С этой целью платформа могла бы определять различные вредные и полезные эффекты для различных мутаций. Исследователи также изучили, как функциональные эффекты могут отражать реальную эволюцию вируса.

Интересно, что результаты были точными по сравнению с реальными наблюдениями по сравнению с более ранними экспериментами, «по- видимому, потому, что наши эксперименты имитируют истинную биологическую функцию спайка лучше, чем эксперименты по отображению клеточной поверхности ». Тем не менее, мутации с положительными функциональными показателями не обогащались в ходе естественной эволюции, возможно, из-за разницы в давлении отбора между лабораторией и естественной средой.

Ранние мутации D614G остаются непревзойденными по своей способности повышать инфекционность.

Выводы

В совокупности результаты исследования обеспечивают высокоточные крупномасштабные измерения воздействия спайковых мутаций. Таким образом, обсуждаемая здесь платформа может помочь идентифицировать наиболее вероятные потенциальные будущие ускользающие мутации.

Новая платформа, описанная в текущем исследовании, может оказаться неоценимой при оценке прямого уклонения от нейтрализации в поликлональных сыворотках, которые часто по-разному влияют на связывание и нейтрализацию антител. Кроме того, этот метод можно использовать для оценки новых вариантов шипов и, таким образом, для определения рационального дизайна вакцины.

Исследователи также указывают, что их платформа открывает новые направления для разработки терапевтических антител, показывая, насколько широко нейтрализующие антитела остаются восприимчивыми к мутациям, ускользающим от иммунного ответа, в SARS-CoV-2, тем самым подчеркивая важность консервативных участков спайков.

Связь между генотипом и вирусным фенотипом жизненно важна для понимания того, как давление естественного отбора влияет на эволюцию шиповидного белка. Важно отметить, что эту платформу можно использовать для любого вируса, который можно псевдотипировать для антигенного надзора и разработки вакцин.

Учитывая потенциальную возможность привнесения функции в потенциальные пандемические патогены, такие эксперименты должны регулироваться надлежащим образом, чтобы избежать создания новых рисков при одновременном повышении пользы для общественного здравоохранения.

*Важное замечание

bioRxiv  публикует предварительные научные отчеты, которые не рецензируются экспертами и, следовательно, не должны рассматриваться как окончательные, направляющие клиническую практику/поведение, связанное со здоровьем, или рассматриваться как установленная информация.