В недавнем исследовании, опубликованном в журнале PLOS Pathogens , исследователи исследовали взаимодействие между сиртуином 5 (SIRT5) и белком неструктурного белка коронавируса тяжелого острого респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2) (Nsp14).

Высококонсервативный фермент SARS-CoV-2 Nsp14 необходим для репликации вируса. Неструктурный белок Nsp14 обладает экзорибонуклеазной и N7-метилтрансферазной активностью и образует устойчивый комплекс с Nsp10. SIRT5 человека был обнаружен в межактомных исследованиях белков как потенциальный партнер по связыванию Nsp14.

Было обнаружено, что никотинамидадениндинуклеотид (НАД)-зависимая протеиндеацилаза SIRT5 удаляет сукцинильные и малониловые группы из остатков лизина, что необходимо для клеточного метаболизма.

Об исследовании

В настоящем исследовании исследователи оценили характеристики взаимодействия Nsp14 и SIRT5 SARS-CoV-2, а также функцию SIRT5 при инфекции SARS-CoV-2.

Команда сначала подтвердила и определила природу взаимодействия Nsp14-SIRT5. Вектор экспрессии Nsp14-strep млекопитающих использовали для аффинной очистки. После трансфекции в клетки HEK-293T либо Nsp14-стрептококком, либо зеленым флуоресцентным белком (GFP) в течение 48 часов экстрагировали меченые белки.

Затем изменения термостабильности Nsp14 и SIRT5 в жизнеспособных клетках измеряли с использованием анализа клеточного теплового сдвига (CETSA). Изменение термостабильности измеряли вестерн-блоттингом после трансфекции экспрессионными плазмидами Nsp14 и SIRT5 в клетки HEK-293T либо по отдельности, либо вместе.

NutriBiotic, Immunity, аскорбат натрия, кристаллический порошок, 227 г (8 унций)

Исследование также определило, являются ли Nsp10 и SIRT5 компонентами отдельных комплексов или они также взаимодействуют. Используя интерференцию сгруппированных регулярно расположенных коротких палиндромных повторов (CRISPR) в клетках HEK-293T, команда создала клеточную линию с нокдауном SIRT5 (SIRT5-KD) для удаления эндогенной экспрессии SIRT5. Единственная направляющая рибонуклеиновая кислота (РНК) была выбрана после тестирования нескольких других на протяжении всего исследования. В клетки SIRT5-KD экспрессионные плазмиды, соответствующие SIRT5, Nsp14-strep и Nsp10 с флаговой меткой (Nsp10-Flag), трансфицировали по отдельности или вместе в течение 48 часов. Удаление потенциальной сукциниловой, малонильной или глутарильной группы из Nsp14 было основной гипотезой того, как SIRT5 может изменять белок Nsp14.

Полученные результаты

Исследование показало, что вестерн-блоты подтвердили предыдущие результаты масс-спектрометрии, продемонстрировав, что SIRT5 особенно очищает совместно с Nsp14. Nsp14 и SIRT5 совместно локализованы в одних и тех же клеточных компартментах с преобладанием цитоплазматической и перинуклеарной локализации, что дополнительно продемонстрировано иммунофлуоресценцией, наблюдаемой в клетках альвеолярного базального эпителия человека A549, трансфицированных экспрессионной плазмидой Nsp14.

Когда два белка были совместно трансфицированы, исследователи заметили значительное улучшение стабильности обоих белков. При одиночной трансфекции Nsp14 плохо экспрессировался и был едва заметен. Однако SIRT5 обеспечивает надежный сигнал. В целом эти предварительные результаты показали, что SIRT5 и Nsp14 взаимодействуют в клетках человека и что SIRT5 значительно стабилизирует экспрессию Nsp14.

Аффинная очистка Strep (Strep-AP) подтвердила взаимодействие SIRT5 и Nsp10 с Nsp14. Однако использование Flag-IP для удаления Nsp10 показало, что только Nsp14 очищается совместно с Nsp10. Это продемонстрировало, что Nsp10 и SIRT5 не взаимодействуют. Команда также предположила, что Nsp10 и SIRT5 напрямую конкурируют за связывание Nsp14, поскольку сигнал SIRT5 после Strep-AP, по-видимому, уменьшался в присутствии Nsp10. Поскольку SIRT5 и Nsp10 могут конкурентно связываться с Nsp14, было предсказано, что Nsp14/SIRT5 и Nsp14/Nsp10 будут образовывать разные комплексы.

Команда также заметила, что такие гены, как Y102 и T105, взаимодействуют с удлиненными кислотными цепями сукцинильных или малонильных групп, Q140 и I142 участвуют в связывании НАД, а Н158 каталитически необходим для удаления протона из НАД. H158, Q140 и I142 консервативны во всех сиртуинах; однако специфичные для SIRT5 Y102 и T105 опосредуют селективность к кислотным группам с более длинной цепью.

Связывание SIRT5 было полностью утрачено у мутантов H158Y и Q140A и лишь частично восстановлено при мутации Y102F. Это открытие показало, что для взаимодействия с Nsp14 требуется интактный каталитический домен SIRT5. На стабильность сверхэкспрессированных каталитических мутантов не влияла обработка клеток HEK293T ингибитором протеасом MG-132, что указывало на то, что различные белки могут укладываться правильно.

Команда обнаружила, что SIRT1 и Nsp14 взаимодействовали, но не наблюдалось никаких взаимодействий с SIRT2, SIRT3, SIRT6 или SIRT7. Сигнал SIRT1 оказался слабее, чем сигнал SIRT5. Примечательно, что, как и в случае с SIRT5, мутация каталитического домена SIRT1 или обработка клеток Ex-527, ингибитором SIRT1, блокировала взаимодействие. Это указывает на то, что каталитическая активность SIRT1 необходима для взаимодействия с Nsp14. С другой стороны, обработка клеток специфическим активатором SIRT1, таким как SRT1720, или неспецифическим активатором, таким как ресвератрол, не приводила к какому-либо заметному влиянию на связывание Nsp14. Хотя оба этих активатора проявляли клеточную токсичность при высоких концентрациях, снижение связывания, отмеченное после аффинной очистки, было связано со снижением уровней SIRT5 и Nsp14 на входных дорожках.  

Команда также заметила, что SIRT5 не присутствовал в клетках SIRT5-KO. RT-qPCR измеряла вирусную РНК через три дня в клетках SARS-CoV-2 дикого типа (WT) и SIRT5-KO после заражения штаммом SARS-CoV-2 Wuhan при множественности инфекций 0,1 и 1. Примечательно, что два-три -кратное снижение также было обнаружено в мРНК SARS-CoV-2 в клетках SIRT5-KO в обеих MOI. Эти данные свидетельствуют о том, что SIRT5 необходим для репликации и/или распространения SARS-CoV-2.

В целом результаты исследования показали, что SIRT5 взаимодействовал с вирусным белком Nsp14 и что это взаимодействие происходило без участия Nsp10.