Под микроскопом исследователи часто наблюдают, как различные типы клеток организуются в тканях по своеобразным паттернам, а иногда и редкий тип клеток, который выделяется тем, что занимает уникальное положение, проявляет необычную форму или экспрессирует специфическую молекулу биомаркера. Чтобы определить более глубокое значение своих наблюдений, они разработали подходы для доступа к паттернам экспрессии генов клеток (транскриптомам) путем анализа молекул РНК, полученных из генов, присутствующих в них, которые они могут сопоставить с формами клеток, пространственным положением и молекулярным строением. биомаркеры.

Однако эти подходы «пространственной транскриптомики» по-прежнему захватывают только часть всех молекул РНК клетки и не могут обеспечить глубину и качество анализа, обеспечиваемые методами секвенирования отдельных клеток, которые были разработаны для исследования транскриптомов отдельных клеток, выделенных из тканей. или биожидкости черезМетоды секвенирования следующего поколения (NGS). Они также не позволяют исследователям ориентироваться только на определенные клетки на основе их расположения в ткани, что значительно облегчило бы поиск разрозненных клеточных популяций или редких, трудно изолируемых клеток, таких как редкие клетки мозга с уникальными функциями или иммунные клетки. клетки, проникающие в опухоль. Кроме того, поскольку исходная тканевая среда нарушена, многие методы пространственной транскриптомики и все методы секвенирования отдельных клеток не позволяют исследователям повторно обращаться к своим образцам для проведения последующего анализа, и они являются дорогостоящими, поскольку требуют специализированных инструментов или реагентов .

Новый прогресс, сделанный в Институте биологической инженерии Висса при Гарвардском университете, теперь преодолевает эти ограничения с помощью метода, основанного на нанотехнологиях ДНК, под названием «Light-Seq». Light-Seq позволяет исследователям «геотировать» полный репертуар последовательностей РНК уникальными штрих-кодами ДНК, эксклюзивными для нескольких интересующих клеток. Эти клетки-мишени выбираются с помощью света под микроскопом посредством быстрого и эффективного процесса фотосшивки.

С помощью новой нанотехнологии ДНК последовательности РНК со штрих-кодом затем транслируются в когерентные нити ДНК, которые затем можно собрать из образца ткани и идентифицировать с помощью NGS. Процесс Light-Seq можно повторить с разными штрих-кодами для разных клеточных популяций в одном и том же образце, который остается нетронутым для последующего анализа. Обладая производительностью, сравнимой с методами секвенирования отдельных клеток, он значительно расширяет глубину и объем исследований, возможных на образце ткани. Метод опубликован в журнале Nature Methods .

«Уникальное сочетание функций Light-Seq удовлетворяет неудовлетворенную потребность: возможность выполнять основанный на визуализации, пространственно предписанный анализ глубокой последовательности трудно, если не невозможно выделить клеточные популяции или редкие типы клеток в сохраненных тканях, с помощью одного «однозначное соответствие их высокоточного состояния экспрессии генов с пространственными, морфологическими и потенциально связанными с заболеванием особенностями», — сказал Пэн Инь, доктор философии, один из четырех соответствующих авторов и член основного факультета Института Висса, где его группа разработала Light-Seq. «Таким образом, у него есть потенциал для ускорения процесса биологических открытий в различных областях биомедицинских исследований». Инь также является профессором системной биологии Гарвардской медицинской школы (HMS).

От штрихкодирования in situ к секвенированию ex situ

Проект Light-Seq возглавили Джоселин (Джози) Киши, доктор философии, Синем Сака, доктор философии, и Ниннинг Лю, доктор философии. в группе Инь в Wyss, и Эмма Уэст, доктор философии. в лаборатории Констанс Чепко в HMS. Ранее Киши и Сака разработали SABER-FISH как метод пространственной транскриптомики для визуализации экспрессии генов непосредственно в интактных тканях ( in situ ).). «С SABER-FISH мы все еще были на несколько порядков далеки от захвата полных программ экспрессии генов в клетках с тысячами различных молекул РНК на клетку. Молекулы РНК слишком плотно упакованы, чтобы их можно было полностью захватить с помощью существующих методов визуализации. — сказал соавтор и соавтор Киши. «Light-Seq решает эту проблему, сочетая маркировку штрих-кода высокого разрешения с полнотранскриптомным секвенированием с помощью NGS, что дает нам лучшее из обоих миров и дополнительные ключевые преимущества». Во время исследования Киши была научным сотрудником Wyss по развитию технологий в команде Инь, и теперь вместе с некоторыми из своих соавторов идет по пути коммерциализации Light-Seq.

«Чтобы конкретно секвенировать клетки в специально выбранных местах образцов интактной ткани, мы разработали новый подход для фотосшивания штрих-кодов ДНК с копиями молекул РНК, а также процедуру на основе нанотехнологий ДНК, которая делает их и прикрепленные к ним последовательности РНК читаемыми с помощью NGS. — сказал один из первых авторов Лю, научный сотрудник группы Инь, который ранее участвовал в разработке параллельной платформы штрих-кодирования ДНК для метода визуализации сверхвысокого разрешения под названием «Action-PAINT», который также стал одним из основных компонентов Light-Seq.

Во-первых, праймеры ДНК образуют «пару оснований» с молекулами РНК в клетках и удлиняются для создания копий последовательностей РНК, называемых комплементарными последовательностями ДНК (кДНК). Затем нити штрих-кода ДНК, содержащие сверхбыстрый нуклеотид фотосшивающего агента, в свою очередь, спариваются по основаниям с кДНК в клетках. Они становятся постоянно связанными друг с другом, когда клетка-мишень освещается под микроскопом через оптическое устройство, похожее на трафарет, которое удерживает другие клетки, не являющиеся мишенями, в поле микроскопа в темноте и, таким образом, избавляет их от реакции фотосшивки. После промывания последовательностей ДНК со штрих-кодом из клеток, которые не были постоянно связаны in situ , процедуру можно повторить с другими штрих-кодами и световыми узорами, чтобы пометить больше интересующих областей.

«Чтобы иметь возможность интегрировать этот рабочий процесс штрих-кодирования с NGS, мы разработали новую реакцию сшивания, основанную на нанотехнологии ДНК. Это новшество позволяет нам преобразовывать наши кДНК со штрих-кодом в непрерывные считываемые последовательности. Затем мы можем извлечь полную коллекцию несущих штрих-код последовательности кДНК из образца и анализировать их с помощью стандартных методов NGS», — пояснил Сака, один из авторов исследования, который в настоящее время является руководителем группы в Европейской лаборатории молекулярной биологии в Гейдельберге, Германия. «В конечном счете, каждый штрих-код отслеживает полное считывание транскриптома до предварительно выбранных клеток в образце ткани, которые остаются нетронутыми для последующего анализа. Это дает нам уникальную возможность повторно посетить те же самые клетки после секвенирования для проверки или дальнейшего исследования».

Глазные сложные ткани и редкие клетки

После первой проверки Light-Seq в культивируемых клетках команда Иня захотела применить его к сложной ткани и стала партнером группы Констанс Чепко, доктора философии. в ГМС. Чепко является одним из соавторов исследования и профессором генетики и неврологии в Институте Блаватник в HMS, и исследует развитие сетчатки как модели нервной системы. Киши, Сака и Лю объединили усилия с Уэстом в группе Чепко, чтобы применить Light-Seq к поперечным сечениям сетчатки мыши и профилировать три основных слоя с различными функциями. Исследователи достигли охвата последовательностей, сравнимого с методами секвенирования отдельных клеток, и обнаружили, что тысячи РНК были обогащены между тремя основными слоями сетчатки. Они также показали, что после извлечения последовательности

«Доведя Light-Seq до крайности, мы смогли выделить полный транскриптом очень редкого типа клеток, известного как «дофаминергические амакриновые клетки» (DAC), который чрезвычайно трудно изолировать из-за его сложных связей с другими клетками в организме. сетчатки, извлекая всего от четырех до восьми клеток с индивидуальным штрих-кодом на поперечном срезе», — сказал Уэст. ЦАП участвуют в регулировании циркадного ритма глаза путем точной настройки зрительного восприятия на различные световые воздействия в течение цикла день-ночь. «Light-Seq также выявил РНК, которые специфически экспрессировались в DAC на низких уровнях, а также десятки биомаркерных РНК, специфичных для DAC, которые, насколько нам известно, ранее не были описаны, что открывает новые возможности для изучения этого редкого типа клеток. «, — добавил Уэст.

Открытие области пространственной транскриптомики до NGS также добавляет информацию об уровне отдельных видов РНК. «Наши данные секвенирования ясно показали, что Light-Seq может определять естественные вариации в структуре РНК. В будущем мы очень заинтересованы в использовании Light-Seq, чтобы лучше понять взаимодействие между иммунной системой, клетками, распространяющими заболевание, и различными терапевтические стратегии, такие как генная и клеточная терапия», — сказал Киши.

Технология Light-Seq, разработанная в группе Пэн Иня в рамках Инициативы молекулярной робототехники Института Висса, еще раз показывает, как использование совершенно нетрадиционного подхода и использование синтетической биологии может привести к революционной технологии с большим потенциалом для продвижения как фундаментальных исследований, так и клинической медицины».

Дональд Ингбер, доктор медицинских наук, директор-основатель Wyss

Дональд Ингбер также является профессором сосудистой биологии Джуды Фолкмана в Гарвардской медицинской школе и Бостонской детской больнице, а также профессором биоинспирированной инженерии Хансйорга Висса в Гарвардской школе инженерии и прикладных наук имени Джона А. Полсона.