Вирус оспы обезьян (MPXV), впервые выделенный в 1958 году, представляет собой вирус с двухцепочечной ДНК (дцДНК). Он был признан зоонозным заболеванием, когда в Демократической Республике Конго в 1970 году был обнаружен первый случай заболевания человека. В настоящее время существует глобальная озабоченность по поводу MPXV из-за его более широкой передачи из Центральной и Западной Африки.

Быстрое, сверхчувствительное и специфичное обнаружение необходимо для сдерживания распространения этого вируса. В новом исследовании, размещенном на сервере препринтов medRxiv * , исследователи из Китая разработали анализ MPXV, впервые сочетающий сгруппированные короткие палиндромные повторы с регулярными промежутками и CRISPR-ассоциированный белок (CRISPR/Cas) и амплификацию с помощью рекомбиназы (RAA). Анализ показал высокую селективность и позволил отличить MPXV от других ортопоксвирусов.

Исследование: CRISPR/Cas12a-опосредованное сверхчувствительное тестирование вируса оспы обезьян на месте . Кредит изображения: Пунктирный йети / Shutterstock

Фон

В настоящее время для тестирования MPXV используются такие методы, как твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), полимеразная цепная реакция (ПЦР) и петлевая изотермическая амплификация (LAMP). ПЦР является золотым стандартом, точным и чувствительным, но сложным для развертывания в районах с ограниченными ресурсами. ELISA может давать ложноположительные результаты для недавней или удаленной вакцинации, а недостатки LAMP связаны со сложной конструкцией праймера, плохими количественными характеристиками и т. д. Быстрые, сверхчувствительные и недорогие методы, облегчающие локальное и легкое обнаружение MPXV, по-прежнему отсутствуют.

Об исследовании

CRISPR/Cas впервые был обнаружен в адаптивной иммунной системе прокариот. Система CRISPR/Cas12a интегрирует передачу сигнала, а биораспознавание использовалось для обнаружения нескольких вирусов, включая коронавирус тяжелого острого респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2). Он имеет много преимуществ, связанных с мягкими условиями, высокой чувствительностью, простотой эксплуатации и мощным усилением сигнала.

На сегодняшний день о критических проблемах, связанных с использованием технологии CRISPR для обнаружения MPXV, таких как скрининг зондов, аналитические характеристики, предварительная амплификация и тестирование по месту оказания медицинской помощи (POCT), не сообщалось. Поэтому в текущем исследовании впервые был предложен быстрый и сверхчувствительный анализ, сочетающий амплификацию с помощью рекомбиназы (RAA) и CRISPR/Cas12a, то есть анализ RAA-Cas12a-MPXV. Принцип состоял из трех этапов: амплификация RAA, расщепление CRISPR/Cas12a и вывод сигнала.

Ключевые результаты

На первом этапе RAA, выбирая матрицу ДНК, давала большое количество ампликонов. Это значительно повысило чувствительность анализа. На втором этапе активировалась транс-расщепляющая активность Cas12a, что приводило к расщеплению многочисленных репортеров одноцепочечной ДНК. На последнем этапе были получены два разных режима вывода сигнала: анализ флуоресценции для репортеров FQ и полоска латерального потока, что повысило удобство использования и пригодность анализа RAA-Cas12a-MPXV.

Результаты флуоресценции с матрицами ДНК или без них и продуктом RAA сравнивали для оценки осуществимости анализа. Группа без ДНК была контрольной, которая не показала значительных изменений флуоресценции. Это указывало на то, что в отсутствие матриц ДНК ампликон RAA не генерировался, чтобы его можно было распознать последующим CRISPR/Cas12a.

Для обеспечения большей селективности и чувствительности были сконструированы три пары праймеров, которые связывались с различными сайтами MPXV-специфического гена F3L. Для отбора оптимальных праймеров для будущих экспериментов были проведены анализ флуоресценции RAA-Cas12a-MPXV и электрофорез в агарозном геле (AGE). Третья пара (F2+R2) достигла наиболее яркой полосы удельного усиления.

Были оптимизированы многие важные экспериментальные условия, связанные с системой CRISPR/Cas12a и анализом RAA-Cas12a-MPXV, при этом температура и время реакции RAA были первыми. Далее была оптимизирована система CRISPR/Cas12a с crRNA2.

Было сочтено, что флуоресцентный анализ RAA-Cas12a-MPXV прост в использовании и пригоден для использования в экспресс-тестировании. По сравнению с флуоресцентным анализом PCR-Cas12a-MPXV флуоресцентный анализ RAA-Cas12a-MPXV показал выдающуюся чувствительность с 1000-кратным нижним пределом обнаружения (LOD).

Селективность анализа флуоресценции RAA-Cas12a-MPXV определяли путем сравнения степени флуоресценции, продуцируемой MPXV, с другими вирусами, такими как вирус натуральной оспы (VARV), вирус коровьей оспы (CPXV), коронавирус тяжелого острого респираторного синдрома-2 (SARS- CoV-2), вирус Toxoplasma Gondii (TOXV) и вирус африканской чумы свиней (ASFV). Как наблюдение невооруженным глазом, так и значения флуоресценции показали, что только MPXV индуцирует усиленную флуоресценцию, в то время как другие вирусы этого не делают.

Репортер FAM-Biotin   ( FB — reporter ) был разработан в качестве замены репортеру FQ для флуоресцентного анализа, а затем для POCT был разработан тест с полосками RAA-Cas12a-MPXV в латеральном потоке. Добавление реакционного раствора, содержащего интактные репортеры FAM, расщепленные FAM и биотин, в прокладки для образцов вызывало быстрое связывание комплексов анти-FAM антитело/AuNP с изолированными FAM и репортерами FB по мере того, как образец мигрировал вперед. Наконец, стрептавидин, иммобилизованный на контрольной полосе, захватывал расщепленные биотины и комплексы репортер FB/антитело против FAM/AuNP.

Первоначально контрольная полоса выглядела красной из-за агрегации AuNP. Впоследствии остальные выделенные комплексы FAM/анти-FAM-антитело/AuNP перемещались к тестовой полосе и реагировали с FAM-антителами, приобретая красный цвет. Наконец, ампликоны активировали Cas12a, чтобы расщепить всех репортеров FB. Изменение цвета осталось только на тестовой полосе.

Короче говоря, когда изменение цвета наблюдалось только в тестовой полосе или как в контроле, так и в тестовой полосе, это считалось положительным результатом. Напротив, если изменение цвета обнаруживалось только в контрольной полосе, это указывало на отрицательный результат, т. е. отсутствие матриц ДНК приводило к отсутствию ампликонов для активации Cas12a.

Выводы

Важным преимуществом анализа RAA-Cas12a-MPXV является то, что его можно проводить при более низкой температуре по сравнению с обычными процессами. Важно отметить, что этот анализ был мощным методом диагностики MPXV с превосходной селективностью, чувствительностью и портативностью.

*Важное замечание

medRxiv публикует предварительные научные отчеты, которые не рецензируются экспертами и, следовательно, не должны рассматриваться как окончательные, направляющие клиническую практику/поведение, связанное со здоровьем, или рассматриваться как установленная информация.