В недавнем исследовании, опубликованном на сервере препринтов bioRxiv *, исследователи определили, что кристаллическая структура с разрешением 1,8 Å фосфатазы с двойной специфичностью (DSP) H1 вируса оспы обезьян (MPXV) имеет решающее значение для репликации вируса, что делает его привлекательной противовирусной мишенью.

Число случаев MPX во всем мире продолжает увеличиваться с каждым часом, что обуславливает необходимость разработки эффективных противовирусных терапевтических средств и вакцин для повышения глобальной готовности к MPX и смягчения последствий вирусных инфекций. H1 необходим для репликации MPXV, поскольку он дефосфорилирует белки, такие как A14, F18, A17, а также преобразователь сигнала и активатор транскрипции 1 (STAT1) и ингибирует передачу сигналов интерферона (IFN). Важно отметить, что HI консервативен среди поксвирусов и, таким образом, может использоваться для разработки широкого спектра противовирусных агентов.

Об исследовании

В настоящем исследовании исследователи изучили кристаллическую структуру H1 с разрешением 1,8 Å, чтобы улучшить понимание дефосфорилирования, катализируемого MPXV H1, и разработать точную модель для разработки новых противовирусных препаратов.

Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК), кодирующая H1 изолята MPXV_USA_2022_MA001 текущей вспышки MPXV 2022 г., была синтезирована и клонирована в экспрессионный плазмидный вектор, подтвержденный секвенированием. H1 экспрессировали в клетках Escherichia coli BL21 (или DE3) и бактерии, экспрессирующие H1, лизировали, после чего белок подвергали хроматографическому анализу.

H1 кристаллизовали методом диффузии паров сидячей капли и кристаллы подвергали рентгеноструктурному анализу. Структуру H1 определяли с использованием метода молекулярного замещения со структурой H1 вируса коровьей оспы в качестве модели поиска. Затем было проведено структурное сравнение с протеинтирозинфосфатазой (PTP)/DSP фосфатазами человека.

Координаты MPXV H1 были загружены на сервер Dali и произведен поиск белков с похожими по структуре белками в PDB (банк данных белков) с использованием подмножества PDB50. В результате были идентифицированы структуры 30 фосфатаз со значительным структурным сходством (показатель Z >13). Среди них две фосфатазы человека были кристаллизованы в виде димеров: фосфатазы двойной специфичности человека (hDSP)-5 и 27, и сравнивались способы их димеризации.

Полученные результаты

NOW Foods, жидкий хлорофилл, аромат натуральной мяты, 473 мл (16 жидк. унций)

MPXV H1 состоит из 171 остатка с хорошо подходящей электронной плотностью, асимметричной молекулы H1 и двух симметрично ориентированных молекул H1, образующих димеры в форме бабочки и с заменой доменов. Общая структура H1 включала шесть и четыре альфа-(α)-спирали и бета-(β)-цепи, соответственно, с β-слоем, зажатым между спиралями α2 и α3-α6 по бокам.

Два активных центра располагались проксимальнее С-концов терминальной β-цепи на расстоянии 39 Å. Каждый активный центр содержал триаду остатков цистеин (Cys)-аргинин (Arg)-аспарагиновая кислота (Asp). В каждом активном центре консервативные остатки Arg и Cys находились в петле, связывающей фосфат-ион, расположенной между остатками α4 и β4. Остаток Arg116 петли захватывает ионы фосфата, гуанидиновая группа которых взаимодействует с двумя молекулами ПО (фосфат-кислород), соединенными водородными связями.

Остаток Arg116 гарантировал эффективную ориентацию и связывание субстрата. N-концевые спирали α1 от каждого протомера взаимозаменяемы для обеспечения димеризации H1. Спирали α1 из одного протомера H1 образовывали связанную структуру с тремя спиралями от α4 до α6 соответствующих промоторов, участвующих в спаривании. В основании каталитического кармана остаток Cys110 атакует атомы фосфора во время дефосфорилирования, что приводит к временному образованию промежуточного соединения фермент-фосфат, которое подвергается гидролизу для регенерации неорганического фосфата и фермента.

Атом серы остатка Cys110 был расположен параллельно связи PO, что соответствует связи, образованной при регенерации фермента. Остаток Asp79 участвует в координации с молекулой воды и действует как кислота, способствуя образованию и гидролизу промежуточных соединений. Таким образом, структура H1 указывала на последнюю стадию катализа перед выпуском продукта.

Площадь поверхности, скрытая между двумя промоторами, находилась на расстоянии 1000 Å2 друг от друга и стабилизировалась за счет гидрофобных и гидрофильных взаимодействий. Остатки серина (Ser)14 и треонина (Thr)15 в α1 обнаруживают водородные связи с остатками гистидина (His)143 и тирозина (Tyr)142/лизина (Lys)159 соответствующего протомера H1 соответственно. Напротив, остатки Tyr7, лейцина (Leu)11 и Leu12 участвовали в гидрофобных связях с остатками метионина (Met)135, Leu139, Lys159, изолейцина (Ile)163, валина (Val)167 и Ile168 из H1-спаривания. .

Остатки Leu136, Leu139 и Met135 в α5 обращены к остаткам димера, ассоциированным с симметрией, для расширения поверхности гидрофобного связывания. Остаток α1 был стабилизирован с помощью гидрофобных взаимодействий и внутримолекулярных водородных связей между остатками α1 и α5. Димер H1 был подтвержден хроматографическим анализом, что указывает на то, что димеры представляют собой функциональные состояния.

Кристаллическая структура MPXV H1 выявила две горячие точки для разработки новых противовирусных препаратов. Место контакта димера представляет собой горячую точку, уникальную для молекул PTP/DSP. Ингибирование димеризации H1 может потенциально ингибировать димеризацию и дефосфорилирование активированного гомодимера фосфор-тирозин STAT1. Второй горячей точкой является активный центр, который, несмотря на то, что он расположен вокруг петель, связывающих фосфат-ионы, с сопоставимой структурой основной цепи, имеет разные боковые цепи, и, следовательно, специфичность субстрата может быть изменена, что открывает путь для разработки противовирусных препаратов.

В целом, результаты исследования продемонстрировали кристаллическую структуру H1 с высоким разрешением, которая обеспечивает прочную основу для дальнейшего механистического анализа и разработки новых противовирусных препаратов против новых вирусных патогенов.

*Важное замечание

bioRxiv публикует предварительные научные отчеты, которые не рецензируются экспертами и, следовательно, не должны рассматриваться как окончательные, направляющие клиническую практику/поведение, связанное со здоровьем, или рассматриваться как установленная информация.