В недавнем исследовании, опубликованном на сервере препринтов bioRxiv *, международная группа исследователей разработала антиген, связывающий домен рецептора (RBD) коронавируса тяжелого острого респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2) второго поколения (RBD-J6) с помощью молекулярной инженерии. с двумя дополнительными заменами аминокислот (аа) (мутации S383D и L518D) в гидрофобном криптическом ядерном эпитопе RBD для повышения стабильности и экспрессии против вызывающих озабоченность вариантов SARS-CoV-2 (VOC).

Исследование: молекулярная инженерия загадочного эпитопа в Spike RBD повышает технологичность и расширяет возможности нейтрализации вариантов SARS-CoV-2 . Кредит изображения: Design_Cells / Shutterstock

Необходимы вакцины против сарбековируса, которые можно производить и распространять среди стран с низким и средним уровнем дохода. Субъединичные белковые вакцины производились экономически эффективно в больших масштабах с удобными температурными требованиями, из которых несколько вакцин продемонстрировали эффективность против SARS-CoV-2.

Авторы исследования ранее проводили эксперименты по молекулярной инженерии, чтобы улучшить производство и стабильность RBD в дрожжах. В результате они разработали модифицированный вариант шиповидного (S) белка SARS-CoV-2 RBD-антигена (RBD-J) с улучшенной иммуногенностью и технологичностью по сравнению с предковым (Wuhan-Hu-1) штаммом RBD.

Об исследовании

В настоящем исследовании исследователи расширили свой предыдущий анализ, выполнив дальнейшие молекулярно-инженерные анализы сконструированного RBD SARS-CoV-2.

Гидрофобный участок на ядре RBD проксимальнее С-конца был модифицирован [уменьшен или устранен мутациями] для улучшения стабильности, растворимости и секреции RBD. Для анализа была выбрана 21 аминокислотная замена, которая, как ранее сообщалось, повышает экспрессию RBD в дрожжах при сохранении способности связывания ангиотензинпревращающего фермента (ACE2). Каждый из них оценивался индивидуально. Каждый RBD содержал мутацию L452K, которая, как было показано авторами ранее, улучшает стабильность и экспрессию RBD.

Kyolic, Aged Garlic Extract, выдержанный экстракт чеснока с лецитином, 200 капсул

Каждый вариант RBD переносили в дрожжи для оценки секреции RBD. Были оценены комбинации трех мутаций аспарагиновой кислоты , включая мутации L452K и F490W в рецептор-связывающем мотиве (RBM) гидрофобного участка ядра RBD. Сравнивали физиологические свойства RBD-J6 и RBD-J. Были проведены эксперименты по спектроскопии кругового дихроизма (CD) в дальнем УФ-диапазоне, дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC), статическом рассеянии света (SLS), высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенной фазой (HPLC) и биослойной интерферометрии (BLI).

Оценивали связывание RBD-J6 с ACE2 и несколькими nAb ( нейтрализующими антителами ), нацеленными на различные эпитопы RBD. Затем команда оценила повышение поликлональных антител в RBD-J, связанное с мышами, вакцинированными RBD-J6, и связывание серологических антител, полученных от инфицированных SARS-CoV-2 Delta VOC и мессенджера рибонуклеиновой кислоты коронавирусной болезни 2019 (COVID-19) (мРНК). ) оценивали выздоравливающих, иммунизированных вакциной к первоначально (RBD-J) и впоследствии (RBD-J6) сконструированным RBD. Команда исследовала, будут ли преимущества технологичности и стабильности, полученные от введения мутаций в гидрофобный пластырь RBD-J6, также полезны для антигенов RBD , содержащих мутации альфа- и бета-летучих органических соединений.

Три мутации Beta VoC RBD (K417N, E484K и N501Y) были добавлены к RBD-J6 (далее обозначаемому как RBD-J6 β). Иммуногенность RBD, изначально содержащих мутацию Beta VOC, и впоследствии сконструированных RBD, конъюгированных с HBsAg VLP (вирусоподобной частицей поверхностного антигена гепатита B), сравнивали. Кроме того, трансгенным мышам K18-hACE2 (человеческий ACE2) внутримышечно вводили либо конъюгат VLP-RBD с квасцовым адъювантом, либо мРНК-вакцину Pfizer-BioNTech дважды с интервалом в три недели, чтобы определить влияние замен аа RBD-J6 на иммуногенность сконструированной вакцины.

Серологический ответ оценивали в отношении RBD ЛОС SARS-CoV-2 через две, пять и семь недель после вакцинации. Через семь недель мышей K18-hACE2, вакцинированных RBD-J β и RBD-J6 β, заражали альфа-ЛОС или бета-ЛОС. Кроме того, определяли титры РНК SARS-CoV-2 в тканях черепа и легких мышей и оценивали нейтрализацию ЛОС SARS-CoV-2.

Полученные результаты

RBD-J6 показал связывание с сывороткой выздоравливающих индивидуумов Delta и со всеми протестированными nAb, за исключением nAb основного класса RBD, нацеленных на эпитоп эпитопа (EY6A и CR3022). Модификация гидрофобного пластыря улучшила титры секреции RBD в три раза и повысила стабильность; однако модификации теперь показали значительные различия в иммуногенности или антигенности RBD.

Конъюгированные VLP-RBD индуцировали у мышей перекрестный реактивный иммунитет против летучих органических соединений SARS-CoV-2, таких как альфа и бета. Дополнительные мутации в RBD-J6 повысили продуктивность RBD в четыре раза по сравнению с исходным штаммом RBD, а три мутации аспарагиновой кислоты (S383D, R408D и L518D) наиболее заметно улучшили экспрессию RBD с 60 мг/л до 173 мг/л. Кроме того, RBD-J6 показал пониженную гидрофобность поверхности. Tm (температура термического плавления) RBD-J6 (63°C) была выше, чем у RBD-J во всех температурных анализах, что указывает на более высокую конформационную и коллоидную стабильность RBD-J6, а сконструированный RBD был дестабилизирован адъюванты алюминия и CpG.

Статус вакцинации не изменил аффинность связывания как сконструированных RBD для ACE2, сыворотки реконвалесцентов Delta, так и протестированных nAb. RBD-J6 β также показал такое же связывание ACE2, как и RBD-J6, и не было отмечено увеличения связывания ACE2 при добавлении мутаций Alpha и Beta VOC RBD. Шины РНК SARS-CoV-2 были на 30% ниже в мозге и легких мышей в случае экспрессии RBD-J6 β по сравнению с экспрессией RBD-J6, а легкие демонстрировали меньшее воспаление после заражения Alpha VOC или Beta VOC. Эффективность перекрестной нейтрализации VLP-β-конъюгата RBD-J6 и мРНК-вакцины против COVID-19 компании Pfizer была сопоставимой.

В целом, результаты исследования выявили потенциальное использование RBD-J6 для улучшения разработки субъединичных вакцин на основе RBD с большей технологичностью, стабильностью и доступом для стран с низким и средним уровнем дохода.  

*Важное замечание

bioRxiv публикует предварительные научные отчеты, которые не рецензируются экспертами и, следовательно, не должны рассматриваться как окончательные, направляющие клиническую практику/поведение, связанное со здоровьем, или рассматриваться как установленная информация.