В недавнем исследовании, опубликованном в журнале Nature , исследователи продемонстрировали, что белок коронавируса тяжелого острого респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2) функционирует как мимик гистонов, нарушая эпигенетическую регуляцию клеток-хозяев.

Недавние данные указывают на то, что инфекция SARS-CoV-2 подавляет врожденные иммунные реакции и нарушает эпигенетическую регуляцию. Однако остается неизвестным, как это происходит. В редких случаях другие вирулентные вирусы могут нарушать эпигенетическую регуляцию, имитируя белки хозяина, особенно гистоны. Гистоны оборачивают ДНК в сложные структуры и регулируют доступ к геному.

Гистоны претерпевают ряд посттрансляционных модификаций (ПТМ), которые динамически регулируются для контроля экспрессии генов. Мимикрия гистонов позволяет вирусам нарушать способность клеток реагировать на инфекцию и регулировать экспрессию генов. Тем не менее мимикрия гистонов коронавирусами (CoV) еще не подтверждена.

Исследование и выводы

В настоящем исследовании изучалось, использует ли SARS-CoV-2 мимикрию гистонов для нарушения регуляции хроматина и ответа на инфекцию. Сначала исследователи провели биоинформатическое сравнение белков SARS-CoV-2 с человеческими гистонами. Было обнаружено идентичное совпадение шести остатков между аминокислотами 50-55 открытой рамки считывания 8 ( ORF8 ) и критическими областями на N-конце гистона H3.

Эти остатки лежат в неупорядоченной области на поверхности мономерной ORF8. Интересно, что в этом мотиве была обнаружена последовательность ARKS, которая присутствует в хвосте H3 в двух разных местах. Протеомная характеристика выявила ДНК-метилтрансферазу 1 (DNMT1) в качестве партнера по связыванию ORF8.

Затем была исследована внутриклеточная локализация ORF8, чтобы выяснить, функционирует ли он как имитатор гистонов. Клетки HEK293T трансфицировали меченной Strep конструкцией, кодирующей ORF8, которую визуализировали с помощью флуоресцентного зонда. Иммунофлуоресценция показала, что ORF8 обычно локализуется в цитоплазме и на периферии ядра.

Однако фракционирование клеток показало, что они расположены как в ядре, так и в цитоплазме. Кроме того, команда обнаружила, что ORF8 была локализована совместно с ламинами B1 и A/C в трансфицированных клетках. Паттерн экспрессии был подтвержден в клеточной линии A549, инфицированной SARS-CoV-2, экспрессирующей ангиотензинпревращающий фермент 2 (ACE2). Затем оценивали связывание хроматина с использованием возрастающих концентраций солей. ORF8 диссоциирует от фракции хроматина при тех же концентрациях солей, что и ламины и гистоны.

Напротив, делеция мотива ARKSAP в ORF8 (ORF8 ΔARKSAP ) позволяет ему диссоциировать при более низких концентрациях солей, указывая на то, что предполагаемый мотив, имитирующий гистоны, влияет на силу ассоциации между ORF8 и хроматином. Иммунопреципитация хроматина с секвенированием (ChIP-seq) продемонстрировала обогащение ORF8 в определенных областях генома, особенно тех, которые связаны с модификацией H3K27me3.

Также было обнаружено, что ORF8 связана с лизин-ацетилтрансферазой 2A (KAT2A). ORF8 ΔARKSAP не был связан с белками хроматина, что свидетельствует о том, что мотив ARKSAP усиливает ассоциацию ORF8 с белками хроматина. Был проведен целенаправленный масс-спектрометрический анализ, чтобы проверить, модифицирован ли сайт, имитирующий гистоны, так же, как и гистоны. Это идентифицировало остаток лизина в предложенном мимическом сайте, который был ацетилирован, подобно гистону H3.

Кроме того, экспрессия ORF8 вызывала заметное снижение численности KAT2A, в то время как уровни белков ядерной ламины и ассоциированного с ламиной гетерохроматина оставались неизменными или слегка повышались. Затем команда обнаружила, что гистоновые PTM, связанные с репрессией транскрипции, были увеличены в трансфицированных клетках HEK293T, которые экспрессировали ORF8, тогда как те, которые связаны с экспрессией активного гена, были истощены. В частности, те, что в мотиве ARKS H3, были сильно нарушены.

Анализ доступного для транспозазы хроматина с помощью высокопроизводительного секвенирования показал, что ORF8 снижает доступность хроматина, но не ORF8 ΔARKSAP . Секвенирование РНК проводили для определения дифференциально экспрессируемых генов (DEG) в трансфицированных клетках. ORF8 и ORF8 ΔARKSAP имеют общее подмножество DEG, но присутствие мотива, имитирующего гистоны, приводит к менее динамичным изменениям в экспрессии генов.

Гены с пониженной экспрессией в ответ на ORF8 по сравнению с ORF8 ΔARKSAP имели большую доступность хроматина и более высокие базовые уровни модификации H3K9ac, чем гены с повышенной экспрессией. Затем был создан мутантный SARS-CoV-2, лишенный ORF8 (SARS-CoV-2 ΔORF8 ); Клетки A549 ACE2 были инфицированы этим мутантом или SARS-CoV-2, чтобы сравнить уровни вирусного генома и продукцию вирусных частиц.

Через 24 часа не было различий в вирусных титрах или количестве копий генома, а через 48 часов были очевидны лишь незначительные изменения. Инфекция SARS-CoV-2 вызывала значительное увеличение репрессивных гистоновых PTM (H3K9me3 и H3K27me3). Наоборот, этот эффект ослаблялся в отсутствие ORF8.

Дальнейшие эксперименты с мутантным SARS-CoV-2, в котором мотив ARKSAP был делетирован из ORF8 (SARS-CoV-2 ΔARKSAP ), выявили существенное ослабление воздействия инфекции на H3K9ac и доступность хроматина, повторяя эффекты делеции ORF8 . Инфекция SARS-CoV-2 дикого типа снижала экспрессию KAT2A, тогда как инфекция SARS-CoV-2 ΔARKSAP или SARS-CoV-2 ΔORF8 не снижала.

Наконец, клетки легкого альвеолярного типа II (iAT2), полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК), были инфицированы вирусами SARS-CoV-2 дикого типа и мутантными. Количество копий генома мутантных вирусов было снижено через 48 часов после заражения, что означает, что ORF8, особенно мотив ARKSAP, влияет на репликацию вируса. Вирусные частицы, генерируемые мутантом ΔORF8, были ниже, чем у вируса дикого типа. Напротив, мутант ΔARKSAP оказался сходным с SARS-CoV-2 дикого типа, что означает, что ORF8 имеет независимую от ARKSAP функцию генерации вирусных частиц.

Выводы

Исследование показало, что ORF8 SARS-CoV-2 содержит мотив ARKS и что экспрессия ORF8 нарушает регуляцию гистоновых PTM. Исследователи обнаружили ассоциацию ORF8 с белками, ассоциированными с хроматином, ядерной пластинкой и гистонами. Подобно гистонам, ORF8 подвергается ацетилированию в пределах мимического мотива гистонов.

Делеция ORF8 вызывала снижение репликации вируса в клетках iAT2, тогда как на количество копий вирусного генома явно влияла потеря мимического мотива гистонов. В целом исследователи выявили новый случай мимикрии гистонов во время инфекции SARS-CoV-2 и описали механизмы, с помощью которых вирус нарушает регуляцию хроматина в клетках-хозяевах.