В недавнем обзоре, опубликованном в журнале Trends in Analytical Chemistry , исследователи представили всесторонний обзор современных методов, используемых для обнаружения коронавируса тяжелого острого респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2) в жидкостях организма.

Постоянное появление новых вариантов SARS-CoV-2 угрожает диагностическим возможностям существующих методов и эффективности вакцин. Клиническая картина COVID-19 может быть недостаточной для того, чтобы отличить инфекции SARS-CoV-2 от других легочных инфекций, что требует высокочувствительных, специфических и точных диагностических методов для обнаружения SARS-CoV-2 в выделениях из носа, слюне, кровь, сперма или фекалии.

Исследование: текущие тенденции в диагностике COVID-19 и его новых вариантов в физиологических жидкостях: поверхностные антигены, антитела, нуклеиновые кислоты и секвенирование РНК . Кредит изображения: НИАИД

Об обзоре

В настоящем обзоре исследователи всесторонне обсудили обнаружение SARS-CoV-2 в жидкостях организма на основе используемых биомаркеров (например, поверхностных антигенов, антител и нуклеиновых кислот) и методов.

Большинство методов диагностики основаны на антигенах SARS-CoV-2, рибонуклеиновой кислоте (РНК), антителах и целых вирусах. Кроме того, такие методы, как иммуноферментный анализ с латеральным потоком (ИФА), твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА) и биосенсоры, используются для выявления перенесенной инфекции на основе наличия антител против SARS-CoV-2 или активной инфекции на основе вируса SARS-CoV-2. 2 наличие антигена.

Молекулярные методы обнаружения SARS-CoV-2 включают полимеразную цепную реакцию с обратной транскрипцией (RT-PCR), изотермическую амплификацию, опосредованную петлей RT (RT-LAMP), и кластеризованные короткие палиндромные повторы с регулярными интервалами (CRISPR). В то время как ИФА и ОТ-ПЦР требуют от двух до пяти часов ≥2 для обнаружения SARS-CoV-2, биосенсоры и LFIA могут обнаружить SARS-CoV-2 в течение нескольких минут.

Методы обнаружения SARS-CoV-2 можно в широком смысле классифицировать как (i) анализы нуклеиновых кислот , основанные на обнаружении нуклеиновых кислот SARS-CoV-2 (например, RT-PCR, RT-LAMP, микрочипы, CRISPR, секвенирование РНК и биосенсоры), и (ii) иммунологические анализы, основанные на обнаружении антигена или антитела (например, LFIA, ELISA, биосенсоры и спектроскопия).

Анализы нуклеиновых кислот для обнаружения SARS-CoV-2

Jarrow Formulas, лютеин, 20 мг, 120 капсул

Анализы нуклеиновых кислот используются для прямого, чувствительного и специфического обнаружения РНК SARS-CoV-2 в образцах, количество которых указывает на наличие или отсутствие COVID-19. ОТ-ПЦР является золотым стандартом молекулярного обнаружения SARS-CoV-2 благодаря своей высокой чувствительности и основан на амплификации нуклеиновых кислот; однако ОТ-ПЦР может давать ложноотрицательные результаты из-за вариаций последовательности вирусной РНК, низкой вирусной нагрузки и неправильного сбора образцов верхних дыхательных путей. Кроме того, ОТ-ПЦР является дорогостоящим, трудоемким и требует обученного персонала и оборудования.

Анализы RT-LAMP основаны на смещении цепи аутоциклической дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) при комнатной температуре и включают одноэтапную обратную транскрипцию и обнаружение невооруженным глазом на основе изменения цвета. Анализы могут обнаруживать РНК SARS-CoV-2 в мазках из ротоглотки, мазках из носоглотки и образцах сыворотки с низкой вирусной нагрузкой (480 копий РНК). Однако анализы не проводятся для массового тестирования на COVID-19.

Анализы на основе ДНК-микрочипов используются для быстрого, точного, чувствительного, специфичного и эффективного анализа экспрессии генов в образцах мазков из носоглотки и включают гибридизацию олигонуклеотидов и комплементарной ДНК (кДНК). Анализы CRISPR обнаруживают РНК SARS-CoV-2 с использованием Cas13, который может вырезать последовательности репортерной РНК в ответ на активацию направляющей РНК, специфичной для SARS-CoV-2. С помощью анализов CRISPR SARS-CoV-2 можно легко обнаружить с помощью бумажных полосок с высокой специфичностью или чувствительностью. Однако требуется обученный персонал и дополнительный этап амплификации ДНК, что делает анализы CRISPR менее экономичными, чем RT-PCR и RT-LAMP.

Секвенирование следующего поколения (NGS) — это высокопроизводительный метод капиллярного электрофореза для точного и быстрого секвенирования SARS-CoV-2. Он используется для подтверждения результатов RT-PCR и RT-LAMP, особенно для образцов с низким содержанием SARS-CoV-2. Однако требуется дорогостоящее оборудование и химические вещества, что ограничивает его использование для диагностики по месту оказания медицинской помощи (POC).

Схематическое изображение (а) мультяшной модели, показывающей структуру SARS-CoV-2, (б) структуру генома и кодируемых белков и (в) мутацию в шиповидных белках . Изображение было создано с помощью BioRender.

Иммунологические тесты для обнаружения SARS-CoV-2

Обычно используются быстрые тесты на антигены, такие как LFIA, поскольку их можно проводить в непосредственной близости от пациента для надежного обнаружения SARS-CoV-2. Антитела иммуноглобулина M (IgM), IgA и IgG вырабатываются иммунной системой против SARS-CoV-2, что может служить индикатором инфекции. Продукция IgM вначале увеличивается в первую фазу инфекции, а затем быстро снижается, в то время как IgG вырабатывается во второй фазе и остается в крови после выздоровления.

LFIA включает связывание антител IgG и IgM с антигенами SARS-CoV-2 и образование комплексов антиген-антитело, которые связываются со вторичными антителами (антитела против IgG человека и антитела против IgM человека) и образуют сэндвич-антитела между белком нуклеокапсида (N) SARS-CoV-2. и вторичные антитела. Отрицательные и положительные тесты обозначены одной и двумя цветными линиями соответственно. LIFA показал 10 3 -кратную и 10 5 — кратную меньшую чувствительность, чем вирусная культура и ОТ-ПЦР соответственно.

ИФА — это чувствительный высокопроизводительный лабораторный тест, который может обнаруживать как вирусные антигены, так и антитела хозяина к специфическим антигенам SARS-CoV-2, таким как белок N, субъединица 1 (S1) белка спайка (S) и S RBD. Анализы ELISA обладают высокой чувствительностью и специфичностью и используются в качестве дополнительных диагностических инструментов для ОТ-ПЦР.

Биосенсоры — это аналитические устройства, используемые для неинвазивного, количественного, быстрого, чрезвычайно чувствительного и экономичного обнаружения ПОК SARS-CoV-2 на основе реализации связывания вирусных компонентов (фермента, антитела, пептида или нуклеиновой кислоты) с их рецепторы, обнаруженные датчиком. Доступны несколько типов биосенсоров, таких как оптические, физические, электронные и электрохимические биосенсоры. Кроме того, сообщалось о быстром, чувствительном и специфичном обнаружении COVID-19 с помощью спектроскопических методов, таких как спектроскопия комбинационного рассеяния, ATR-FTIR (инфракрасная спектроскопия с ослабленным полным отражением и преобразованием Фурье) и спектроскопия в ультрафиолетовом и видимом диапазонах (UV-vis).

В целом, результаты обзора подчеркивают область диагностики COVID-19, включая обнаружение SARS-CoV-2 на основе нуклеиновых кислот и иммуноанализа в жидкостях организма.