В недавнем исследовании, опубликованном в  PLOS ONE , ученые разработали систему полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией и количественной ПЦР (RT-qPCR) для выявления вызывающих озабоченность вариантов Omicron (VOC) коронавируса тяжелого острого респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2).

Фон

Чтобы остановить распространение вновь обнаруженных вариантов SARS-CoV-2 и разработать методы оценки их патогенного потенциала, необходимы эффективные меры эпиднадзора. Это имело решающее значение для варианта SARS-CoV-2 Omicron (B.1.1.529), который преобладал после распространения варианта Delta. Процедуры RT-qPCR, особенно в странах с ограниченными ресурсами, дополняют секвенирование всего генома. Однако изменения в последовательностях целевого праймера и зонда вновь появляющихся вариантов могут привести к сбою существующих RT-qPCR.

Об исследовании

В настоящем исследовании команда разработала метод RT-qPCR, который одновременно выявлял варианты SARS-CoV-2 Delta и Omicron, используя вырожденный зонд, специально нацеленный на ключевую мутацию спайкового белка ΔH69/V70.

Был получен контрольный образец синтетической рибонуклеиновой кислоты (РНК) TWIST SARS-CoV-2, который был использован в качестве стандартного альфа-варианта ПЦР (B.1.17) в семиэтапной серии разведений 1:10 при указанной концентрации. Чтобы проверить, работают ли анализы RT-qPCR со всеми циркулирующими ЛОС, образцы были получены от пациентов с подтвержденной секвенированием всего генома (WGS) инфекцией SARS-CoV-2 дикого типа (WT), альфа-, дельта- или омикронного варианта. Вкратце, общественные центры тестирования, которые были частью датской национальной программы тестирования, получили мазки из горла и проверили их на наличие SARS-CoV-2.

Для постановки первичного диагноза COVID-19 использовали RT-qPCR. С помощью WGS была подтверждена идентичность линий BA.1, BA.2, BA.4 и BA.5, а консенсусные геномы были депонированы в Глобальной инициативе по обмену всеми данными о гриппе (GISAID). Инактивированные нагреванием датские вирусные изоляты, соответствующие вариантам Альфа и Дельта, культивированные в клетках Vero E6, считались положительными контролями, в которых учитывались основные мутации (ΔH69/V70 и L452R), которые присутствовали в вариантах Альфа, Дельта и Омикрон. Кроме того, культуры выделяли, культивировали и разводили.

Для каждой основной мутации в спайковом гене было создано два зонда для проведения анализа дискриминации аллелей: один для обнаружения нуклеотидной последовательности дикого типа, а другой для обнаружения мутации на основе выравнивания последовательностей. Наличие SARS-CoV-2 и оценку вирусной нагрузки определяли с помощью метода RT-qPCR, нацеленного на ген оболочки (E) в качестве неспецифического контроля.

Полученные результаты

Команда оценила рабочие характеристики ΔH69/V70 RT-аналитической количественной ПЦР, прежде чем включить их в вариантную ПЦР, используемую в исследовании для качественного обнаружения варианта Omicron в клинических образцах. Для ΔH69/V70 RT-qPCR клинические образцы, инфицированные SARS-CoV-2 Omicron, альфа-вариантом, использовались в качестве положительных контролей, в то время как инфицированные Ухань и дельта, а также отрицательные образцы SARS-CoV-2 служили в качестве отрицательных контролей. Благодаря использованию E-Sarbeco RT-qPCR, мультиплексированной с ΔH69/V70 RT-qPCR, присутствие SARS-CoV-2 было подтверждено в положительных образцах.

Кроме того, исследователи разработали вырожденный зонд ΔH69/V70 для идентификации мутации ΔH69/V70, присутствующей во всех известных вариантах SARS-CoV-2. Размещение вырожденного зонда вместо исходного, нацеленного на ΔH69/V70, позволило вариантам Alpha и Omicron почти полностью восстановить свою конечную интенсивность флуоресценции. Отсутствие сигнала от вариантов SARS-CoV-2, не имевших делеции ΔH69/V70, и отрицательных контролей стало дополнительным свидетельством специфичности дегенеративного зонда. Зонд WT в ΔH69/V70 RT-qPCR использовали для различения подвариантов BA.1 и BA.2. Зонд ΔH69/V70 WT успешно обнаружил все варианты SARS-CoV-2, включая WT, Delta и Omicron BA.2, в которых отсутствовал ген ΔH69/V70.

Из каждого из 745 образцов, положительных на SARS-CoV-2, были получены достоверные результаты RT-qPCR и консенсусная последовательность генома. В общей сложности 339 образцов пациентов были идентифицированы как имеющие инфекции BA.1, тогда как 399 образцов имели инфекции BA.2, согласно анализу WGS, что указывает на то, что два генома распределены довольно равномерно. Остальные семь образцов пациентов содержали дельта-геном. Вырожденный зонд ΔH69/V70 идентифицировал мутацию ΔH69/V70 в образцах 339 пациентов, что соответствует 100% корреляции с образцами Omicron BA.1.

Кроме того, сигнал WT происхождения Delta или Omicron BA.2 присутствовал в 406 клинических образцах, которые были положительными на SARS-CoV-2. Семь из этих 406 образцов также оказались положительными в отношении мутации 452R, типичной для дельта-вариации. Независимо от сублиний BA.1 и BA.2, последовательность L452-WT была обнаружена в 738 из 745 образцов пациентов, что коррелировало с вариантом Omicron. .1 и BA.2 различия в широком масштабе, что подтверждено сравнением данных RT-qPCR и WGS.

Вывод

В целом, результаты исследования показали, что, объединив параллельный анализ двух различных сигнатурных мутаций, ΔH69/V70 и L452R, команда эффективно обнаружила подлинии SARS-CoV-2 Omicron, а также вариант Delta.