Теломеры представляют собой область, которая составляет конец хромосомы и защищена белками, связывающими теломеры. Эти белки защищают теломеры от распознавания двухцепочечных разрывов ДНК. Во время деления соматической клетки конец теломер не может реплицироваться за счет отстающей нити репликационной вилки, вызывая укорачивание теломер после каждого клеточного цикла.

Если клетки продолжают размножаться, истощение теломер может вызвать клеточное старение. Это явление может быть препятствием для онкогенеза. Тем не менее, чтобы достичь репликативного бессмертия, раковые клетки преодолевают укорочение теломер. Это достигается преимущественно за счет активации теломеразы или использования независимого от теломеразы, но основанного на гомологичной рекомбинации пути, связанного с удлинением или сохранением теломер. Этот механизм известен как альтернативное удлинение теломер (АЛТ).

Альтернативное удлинение теломер (ALT) рака

Опухоли ALT достигают бессмертия за счет повторного удлинения теломер в фазах G2 и M клеточного цикла с помощью пути репликации, индуцированной разрывом (BIR). Предыдущие исследования выявили токсическую природу механизма ALT. Теломеры ALT хорошо транскрибируются и богаты гибридами РНК: ДНК (петли telR). 

Снижение транслоказы FANCM, которая является высококонсервативным белком в пути супрессора опухолей при анемии Фанкони (ФА), и истощение эндорибонуклеазы РНКазы H1 приводят к усилению петель telR, нестабильности теломер и активности АЛТ.

Недавнее исследование PNAS выдвинуло гипотезу о том, что АЛТ может нарушить целостность теломер, если его не ограничить должным образом. Было показано, что ингибирование транскрипции РНК, содержащей теломерные повторы (TERRA), может снизить активность АЛТ. С этой целью ученые использовали эффекторы, подобные активаторам транскрипции, нацеленные на промоторы TERRA, содержащие специфические CpG-богатые повторы длиной 29 пар оснований (T-TALE), и объединили их с доменом подавления транскрипции.

Ключевые результаты

Были разработаны T-TALE, слитый на С-конце с сигналом ядерной локализации (NLS), активатор транскрипции РНК-полимеразы II VP64 и эпитоп гемагглютинина гриппа человека (HA). Ученые клонировали трансген ниже промотора, индуцируемого доксициклином (dox), который использовался для разработки двух независимых клональных клеточных линий, полученных из ALT, U2OS, названных vp6 и vp30.

Y.S. Eco Bee Farms, Маточное молочко, пчелиная пыльца, прополис и корейский женьшень, 90 капсул

Для проверки индуцируемой экспрессии трансгена использовали вестерн-блоттинг с использованием антител против HA. Клетки обрабатывали доксом в течение 24 часов и проводили TERRA qRT-PCR. Транскрипты TERRA из субтеломер, содержащих 29 п.н., были в 3–10 раз выше, чем в необработанных клетках. Однако TERRA из 29 п.н., лишенных субтеломер, остались без изменений.

Нозерн-блот-гибридизация с зондами позволила идентифицировать TERRA из субтеломерных последовательностей 10q или (UUAGGG)n, которые состояли из всех молекул TERRA, которые демонстрировали увеличение видов TERRA при обработке dox. Это открытие указывает на то, что эта система может эффективно улучшать транскрипцию TERRA в клетках U2OS.

На теломерах отслеживали накопление маркера стресса репликации (RPA32), фосфорилированного по серину 33 (pSer33), и маркера повреждения ДНК гистона H2AX, фосфорилированного по серину 139 (γH2AX). ALT контролировали путем количественного определения ALT-ассоциированных телец PML, а события синтеза de novo теломерной ДНК в фазе G2 анализировали путем включения EdU.

Было обнаружено, что лечение Dox неэффективно в отношении уровней TERRA, стабильности теломер и АЛТ. Эксперименты по флуоресцентной гибридизации ДНК  in  situ (FISH) показали, что ингибирование транскрипции TERRA увеличивает количество концов хромосом, лишенных обнаруживаемых сигналов теломерной ДНК на стадии метафазы клеточного цикла. Результаты, задокументированные в этом исследовании, согласуются с предыдущим исследованием, которое показало, что ингибирование транскрипции TERRA может улучшать АЛТ и способствовать прогрессирующему укорочению теломер.

Было замечено, что накопление свободных концов теломер (TFE) в клетках vp6 и vp30, обработанных доксом в течение девяти дней, не оказывало существенного влияния на клетки nls1. Это открытие указывает на то, что механизм потери теломер, отличный от репликативного укорочения, может быть активирован при повышенной транскрипции теломер.

Текущее исследование показало, что обработка доксом и структурно-специфическая эндонуклеаза Mus81, связанная с теломерами ALT, увеличивает частоту теломерных фокусов Mus81 в клетках vp6 и vp30. Истощение Mus81 вызывало увеличение TFEs в клетках nls1 и vp30, которые не подвергались докс-обработке.

Снижение Mus81 предотвращало накопление TFE в клетках vp30, обработанных dox, без предотвращения индукции транскрипции TERRA или накопления pSer33 и γH2AX на теломерах. Это открытие предполагает, что Mus81 может играть важную роль в событиях потери теломер, связанных с усиленной транскрипцией TERRA.

Выводы

Основываясь на экспериментальных данных текущего исследования и отчетах других подобных исследований, авторы предложили модель исследований на основе АЛТ. Это исследование представило доказательства и подчеркнуло, что механизм ALT напрямую связан с молекулярными событиями, которые могут поставить под угрозу стабильность теломер. Следовательно, АЛТ необходимо соответствующим образом контролировать, чтобы обеспечить удлинение теломер и неограниченное клеточное деление без чрезмерной потери теломер. Транскрипция TERRA была идентифицирована как универсальная мишень для терапии рака ALT.