В недавнем исследовании, опубликованном в Viruses , исследователи представили метод прямой плазмидной трансфекции для производства вирусоподобных частиц (VLP) коронавируса тяжелого острого респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2) в клетках насекомых и применили VLP для оценки эффективности моноклональных антитела (мАт) и вакцинированные донорские сыворотки.

Фон

Ограничения биобезопасности ограничивают исследования с использованием аутентичного вируса SARS-CoV-2, поэтому используются псевдовирусные (PV) системы на основе лентивируса или вируса везикулярного стоматита (VSV). Однако полученные частицы PV экспрессируют только один из структурных белков SARS-CoV-2 [оболочка (E), шип (S), мембрана (M) и нуклеокапсид (N). Кроме того, производство фотоэлектрических систем включает сложные процессы и требует лабораторий уровня биобезопасности 2 (BSL2).

В качестве альтернативы можно получить VLP, которые напоминают аутентичные вирусы, собираются сами по себе при коэкспрессии белка SARS-CoV-2 и являются безопасными, поскольку у них нет геномных данных и, следовательно, они не могут реплицироваться. Кроме того, VLPS можно производить в лабораториях BSL1. VLP SARS-CoV-2 обычно производятся в клеточных системах на основе BEVS (бакуловирусной векторной системы экспрессии), которые обеспечивают высокий выход VLP и нейтрализуют SARS-CoV-2 у сирийских хомяков. Таким образом, BEVS-VLP потенциально могут использоваться в качестве вакцин против коронавирусной болезни 2019 (COVID-19).

Об исследовании

В настоящем исследовании исследователи получили VLP SARS-CoV-2 на основе плазмид в системе клеток насекомых и использовали их для клеточного анализа на основе зеленого флуоресцентного белка (GFP) для простого и быстрого скрининга серологического иммунитета, индуцированного антителами против S. и сыворотка.

Команда проанализировала различные конструкции векторов экспрессии и оптимальные соотношения M SARS-CoV-2 для анализов связывания клеток на основе GFP и оценила их эффективность в иммуноферментном анализе (ELISA) на основе S SARS-CoV-2. Впоследствии качество VLP оценивали с помощью просвечивающей электронной микроскопии (TEM), эпифлуоресцентной микроскопии, конфокальной микроскопии (CFM), вестерн-блоттинга и анализа нанотрекинга (NTA) для оценки связывания ангиотензинпревращающего фермента 2 (ACE2) и сходства с аутентичным вирусом SARS. КоВ-2. Кроме того, mAb и сыворотки вакцинированных лиц из Германии подвергали скринингу с использованием разработанных нами анализов ингибирования VLP для оценки их потенциала ингибирования.

E-, M- и S-кодирующие SARS-CoV-2 последовательности дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) штамма SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1 были вставлены в вектор pOpiE2 и временно экспрессированы в клетках High Five. SARS-CoV-2 M был слит с GFP. Для временной экспрессии в клетках Expi293F белок ACE2, лишенный сигнального пептида (SP), встраивали в вектор pCSE2.5.

Gaia Herbs, Turmeric Supreme, куркума, повышенная сила действия, 120 веганских фито-капсул с жидкостью

Экспрессия TMPRSS2 была достигнута путем замены половины плазмиды pCSE2.5-ACE2 ДНК Corona2a1, и были проведены эксперименты по трансфекции, после чего был собран супернатант, содержащий VLP. Кроме того, VLP подвергали электрофорезу в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE), окрашиванию, флуоресценции в геле и анализу иммуноблоттинга.

Обогащенные VLP были проанализированы с помощью сэндвич-анализов ELISA, выполненных с использованием STE90-C11 в качестве антител, специфичных для захвата SARS-CoV-2 S RBD, и растворимых гибридов ACE2-mFc для обнаружения. Такие соотношения, как 1:1:1, 1:1:4, 1:1:6 и 1:1:8 для экспрессии S:E:M и VLP-6M-фурин (VLP-6M без Wuhan-Hu-1 С) были оценены. Концентрированные VLP трансфицировали клетками Expi293F, экспрессирующими ACE2, и проводили анализ проточной цитометрией (FC) для определения количества VLP, связанных с клетками Expi293F, экспрессирующими ACE2.

Полученные результаты

Для коэкспрессии SARS-CoV-2 E, M и S, которые самособирались в VLP, использовались прямые корректировки соотношения плазмид. Слияние белка M с GFP позволило провести прямую количественную оценку ингибирования связывания ACE2 с помощью mAb или сыворотки вакцинированных лиц. Вторичные антитела не требовались для очистки VLP или флуоресцентного мечения для анализа FC. Слияние белков SP и M значительно уменьшало сигнал связывания VLP в сэндвич-анализах ELISA, тогда как слияние SP с белком E усиливало связывание.

Векторы экспрессии VLP кодировали E и S, которым предшествовал SP, тогда как экспрессия M отсутствовала. Анализы сэндвич-ELISA и FC не показали существенных различий в связывании VLP при использовании различных соотношений S:E:M, за исключением незначительного связывания VLP-6M-фурина. Для последующих клеточных анализов команда выбрала VLP-6M. Анализ TEM показал сходные структуры аутентичных вирусов VLP и SARS-CoV-2. Количество S на поверхности VLP коррелировало с количеством вектора экспрессии S, используемого в экспериментах по трансфекции, и приводило к типичной ауре S для VLP-1M, 4M и 6M.

Анализ NTA показал выход 10 13 VLP на литр для всех VLP с более низким выходом (10 12 ) для VLP-6M-фурина. Средний диаметр частиц для VLP-6M составлял 145 нм (VLP-6M), как и у CoV (от 100 до 200 нм). Вестерн-блоттинг и анализ SDS-PAGE показали включение M и S (но не E) в VLP. VLP были видны в виде крошечных зеленых точек на поверхности ACE2-TMPRSS2, коэкспрессирующих Expi293F клеток эмбриональной почки человека (HEK) с автофлуоресценцией.

Количество VLP и интенсивность GFP были немного выше для VLP-6M, чем для VLP-6M-фурина, и варьировались в зависимости от экспрессии ACE2. При анализе FC наблюдались значительные различия между гистограммами VLP-6M VLP и GFP, в которых были идентифицированы две разные популяции, одна из которых экспрессировала связанные VLP-6M и ACE2, а другая — нет. Напротив, для VLP-GM-Furin наблюдался сдвиг популяции, указывающий на более низкую связывающую способность, как видно в ELISA.

Кроме того, эксперименты по оптимизации показали, что анализы связывания клеток можно проводить в течение часа без значительной потери сигнала, а VLP можно хранить при температуре -80 °C. мАт STE90-C11, STE94-F12, STE94-B1-E12 и STE90-B2-D12 (в концентрации 150 мкг/мл) продемонстрировали успешное ингибирование связывания VLP-ACE2, а результаты анализа VLP отражали результаты анализа подлинного SARS-CoV-2. анализы на нейтрализацию. Значительное ингибирование связывания наблюдали при разведении 1:10 сывороток тройных вакцинированных BNT162b2.

Вывод

В целом результаты исследования показали, что производство VLP SARS-CoV-2 с использованием метода прямой плазмидной трансфекции является более простой, быстрой и надежной альтернативой подходу BEVS.