В бразильском исследовании, опубликованном в журнале PNAS , описаны некоторые последствия заражения SARS-CoV-2 для центральной нервной системы. Предварительная версия (еще не рецензированная), опубликованная в 2020 году, была одной из первых, показавших, что вирус, вызывающий COVID-19, может заражать клетки мозга, особенно астроциты. Он также открыл новые горизонты, описав изменения в структуре коры, самой богатой нейронами области мозга, даже в случаях легкой формы COVID-19.

Кора головного мозга представляет собой наружный слой серого вещества над полушариями. Это крупнейшее место нейронной интеграции в центральной нервной системе, которое играет ключевую роль в сложных функциях, таких как память, внимание, сознание и язык.

Расследование проводилось несколькими группами в Государственном университете Кампинаса (UNICAMP) и Университете Сан-Паулу (USP), и все они финансировались FAPESP. Исследователи из Бразильской национальной лаборатории биологических наук (LNBio), Института Д’Ор (IDOR) и Федерального университета Рио-де-Жанейро (UFRJ) также внесли свой вклад в исследование.

«В двух предыдущих исследованиях было обнаружено присутствие нового коронавируса в головном мозге, но никто точно не знал, находится ли он в кровотоке, в эндотелиальных клетках [ выстилающих кровеносные сосуды ] или в нервных клетках. Мы впервые показали, что это действительно так. инфицировать и размножаться в астроцитах, и что это может снизить жизнеспособность нейронов», — сказал Agência FAPESP один из руководителей исследования Даниэль Мартинс-де-Суза. Мартинс-де-Суза — профессор Института биологии UNICAMP и исследователь, связанный с IDOR.

Астроциты являются наиболее многочисленными клетками центральной нервной системы. В их функции входит обеспечение биохимической поддержки и питательных веществ для нейронов; регулирование уровней нейротрансмиттеров и других веществ, которые могут мешать функционированию нейронов, таких как калий; поддержание гематоэнцефалического барьера, защищающего мозг от патогенов и токсинов; и помогает поддерживать гомеостаз мозга.

Заражение астроцитов было подтверждено экспериментами с использованием ткани головного мозга 26 пациентов, умерших от COVID-19. Образцы тканей были собраны во время вскрытий, проведенных с использованием минимально инвазивных процедур Александром Фабро, патологом и профессором Медицинской школы Рибейран-Прету Университета Сан-Паулу (FMRP-USP). Анализ координировал Тьяго Кунья, также профессор FMRP-USP и член Центра исследований воспалительных заболеваний (CRID).

Исследователи использовали метод, известный как иммуногистохимия, процесс окрашивания, при котором антитела действуют как маркеры вирусных антигенов или других компонентов анализируемой ткани. «Например, мы можем вставить одно антитело в образец, чтобы сделать астроциты красными при связывании с ними, другое, чтобы пометить спайковый белок SARS-CoV-2, сделав его зеленым, и третье, чтобы выделить двухцепочечную РНК вируса. который появляется только во время репликации, становясь пурпурным», — объяснил Мартинс-де-Суза. «Когда изображения, полученные в ходе эксперимента, были наложены друг на друга, все три цвета проявлялись одновременно только в астроцитах».

По словам Куньи, наличие вируса было подтверждено в пяти из 26 проанализированных образцов. В этих пяти образцах также были обнаружены изменения, указывающие на возможное повреждение центральной нервной системы.

«Мы наблюдали признаки некроза и воспаления, такие как отек [ припухлость, вызванная скоплением жидкости ], поражение нейронов и инфильтраты воспалительных клеток», — сказал он.

Способность SARS-CoV-2 инфицировать ткань мозга и его предпочтение астроцитам были подтверждены Адриано Себолеллой и его группой в FMRP-USP с использованием метода культур срезов мозга, экспериментальной модели, в которой ткань человеческого мозга получена во время операции. для лечения неврологических заболеваний, таких как резистентная к лекарствам эпилепсия, например, культивируют in vitro и инфицируют вирусом.

Постоянные симптомы

В другой части исследования, проведенного в Школе медицинских наук UNICAMP (FCM), 81 добровольцу, выздоровевшему от легкой формы COVID-19, сделали сканирование головного мозга с помощью магнитно-резонансной томографии (МРТ). Эти сканирования были выполнены в среднем через 60 дней после диагностического тестирования. В то время у трети участников все еще были неврологические или нейропсихиатрические симптомы. Они жаловались в основном на головную боль (40%), утомляемость (40%), нарушения памяти (30%), тревогу (28%), потерю обоняния (28%), депрессию (20%), сонливость в дневное время (25%). потеря вкуса (16%) и низкое либидо (14%).

«Мы разместили ссылку для регистрации людей, заинтересованных в участии в испытании, и были удивлены, увидев более 200 добровольцев всего за несколько дней. Многие из них были полисимптомными, с самыми разными жалобами. пройти неврологическую оценку и пройти стандартизированные тесты для измерения производительности когнитивных функций, таких как память, внимание и умственная гибкость. В статье мы представляем первоначальные результаты», — сказала Кларисса Ясуда, профессор и член Бразильского научно-исследовательского института неврологии и нейротехнологии ( МОЗГ).

В исследование были включены только добровольцы, у которых с помощью ОТ-ПЦР был диагностирован COVID-19 и которые не были госпитализированы. Оценки проводились после окончания острой фазы, и результаты сравнивались с данными для 145 здоровых неинфицированных лиц.

МРТ показало, что у некоторых добровольцев толщина коры в некоторых областях мозга уменьшилась по сравнению со средним показателем для контрольной группы.

«Мы наблюдали атрофию в областях, связанных, например, с тревогой — одним из наиболее частых симптомов в исследуемой группе», — сказал Ясуда. «Учитывая, что распространенность тревожных расстройств среди населения Бразилии составляет 9%, 28%, которые мы нашли, являются тревожно высоким числом. Мы не ожидали таких результатов у пациентов с легкой формой заболевания».

В нейропсихологических тестах, предназначенных для оценки когнитивных функций, добровольцы также показали худшие результаты в некоторых задачах по сравнению со средними показателями по стране. Результаты были скорректированы с учетом возраста, пола и уровня образования, а также степени усталости, о которой сообщил каждый участник.

«Вопрос, который у нас остался, заключается в следующем: эти симптомы временны или постоянны? До сих пор мы обнаружили, что у некоторых субъектов наблюдается улучшение, но, к сожалению, многие продолжают испытывать изменения», — сказал Ясуда. «Что удивительно, так это то, что многие люди были повторно инфицированы новыми вариантами, и некоторые сообщают о более тяжелых симптомах, чем они были с момента первого заражения. со временем и для того, чтобы это понимание послужило основой для разработки таргетной терапии».

Нарушен энергетический обмен

В лаборатории нейропротеомики IB-UNICAMP, которую возглавляет Мартинс-де-Суза, были проведены эксперименты на клетках ткани головного мозга людей, умерших от COVID-19, и астроцитах, культивированных in vitro, чтобы выяснить, как инфекция SARS-CoV-2 влияет на нервную систему. клетки системы с биохимической точки зрения.

Образцы вскрытия были получены в сотрудничестве с группой под руководством Пауло Салдивы, профессора Медицинской школы Университета Сан-Паулу (FM-USP). Протеом (все белки, присутствующие в ткани) картировали с помощью масс-спектрометрии, метода, используемого для идентификации различных веществ в биологических образцах в соответствии с их молекулярной массой.

«Когда результаты сравнили с результатами неинфицированных субъектов, в астроцитах было обнаружено большое количество белков с измененной экспрессией, что подтвердило результаты, полученные с помощью иммуногистохимии», — сказал Мартинс-де-Суза. «Мы наблюдали изменения в различных биохимических путях в астроцитах, особенно в путях, связанных с энергетическим метаболизмом».

Следующим шагом было повторение протеомного анализа культивируемых астроцитов, инфицированных в лаборатории. Астроциты получали из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК). Этот метод заключается в перепрограммировании взрослых клеток (полученных из кожи или других легкодоступных тканей) для достижения стадии плюрипотентности, сходной со стадией эмбриональных стволовых клеток. Эта первая часть была проведена в лаборатории IDOR Стивенса Рехена, профессора UFRJ. Затем команда Мартинс-де-Суза использовала химические стимулы, чтобы заставить ИПСК дифференцироваться в нейральные стволовые клетки и, в конечном итоге, в астроциты.

«Результаты были аналогичны результатам анализа образцов тканей, полученных при вскрытии, в том, что они показали дисфункцию энергетического метаболизма», — сказал Мартинс-де-Суза. «Затем мы провели метаболический анализ [ сосредоточив внимание на метаболитах, продуцируемых культивируемыми астроцитами ], который показал изменения метаболизма глюкозы. По какой-то причине инфицированные астроциты потребляют больше глюкозы, чем обычно, и тем не менее клеточные уровни пирувата и лактата, основных энергетических субстратов , значительно уменьшилось».

Лактат является одним из продуктов метаболизма глюкозы, и астроциты экспортируют этот метаболит в нейроны, которые используют его в качестве источника энергии. Анализ исследователей in vitro показал, что уровень лактата в среде для культивирования клеток был нормальным, но снижался внутри клеток. «Похоже, астроциты стремятся поддерживать снабжение нейронов энергией, даже если это усилие ослабляет их собственное функционирование», — сказал Мартинс-де-Суза.

В результате этого процесса функционирование митохондрий астроцитов (органелл, вырабатывающих энергию) действительно было изменено, что потенциально повлияло на церебральные уровни таких нейротрансмиттеров, как глутамат, который возбуждает нейроны и связан с памятью и обучением, или гамма-аминомасляная кислота. (ГАМК), который подавляет чрезмерное возбуждение нейронов и может способствовать ощущению спокойствия и расслабления.

«В другом эксперименте мы попытались культивировать нейроны в среде, где ранее росли инфицированные астроциты, и измерили более высокую, чем ожидалось, скорость гибели клеток. Другими словами, эта культуральная среда, «кондиционированная инфицированными астроцитами», ослабила жизнеспособность нейронов». — сказал Мартинс-де-Суза.

Выводы, описанные в статье, подтверждают результаты нескольких ранее опубликованных исследований, указывающих на возможные неврологические и нейропсихиатрические проявления COVID-19.

Результаты экспериментов на хомяках, проведенных в Институте биологических наук (IB-USP), например, подтверждают гипотезу о том, что заражение SARS-CoV-2 ускоряет метаболизм астроцитов и увеличивает потребление молекул, используемых для выработки энергии, таких как глюкоза и аминокислота глютамин. Результаты, полученные группой под руководством Жана Пьера Перона, показывают, что это метаболическое изменение нарушает синтез нейротрансмиттера, играющего ключевую роль в коммуникации между нейронами ( подробнее на: agencia.fapesp.br/37383/ ).

Вопросы без ответов

По словам Мартинс-де-Суза, в научной литературе нет единого мнения о том, как SARS-CoV-2 достигает мозга. «Некоторые эксперименты на животных предполагают, что вирус может преодолевать гематоэнцефалический барьер. Есть также подозрение, что он поражает обонятельный нерв и оттуда проникает в центральную нервную систему. Но пока это гипотезы», — сказал он.

Одно из открытий, сделанных в статье PNAS, заключается в том, что вирус не использует белок ACE-2 для проникновения в клетки центральной нервной системы, как это происходит в легких. «Астроциты не имеют белка в своих мембранах. Исследования Флавио Вераса [ FMRP-USP ] и его группы показывают, что в этом случае SARS-CoV-2 связывается с белком нейропилином, демонстрируя его универсальность при заражении различных тканей», — Мартинс. — сказал де Соуза.

В лаборатории нейропротеомики UNICAMP Мартинс-де-Суза проанализировал нервные клетки и другие клетки, пораженные COVID-19, такие как адипоциты, клетки иммунной системы и клетки желудочно-кишечного тракта, чтобы увидеть, как инфекция изменила протеом.

«Сейчас мы собираем данные, чтобы найти особенности и различия в изменениях, вызванных вирусом в этих разных тканях. Тысячи белков и сотни биохимических путей могут быть изменены с вариациями в каждом случае. поиск конкретных методов лечения для каждой системы, пораженной COVID-19», — сказал он.

«Мы также сравниваем протеомные различия, наблюдаемые в тканях мозга пациентов, умерших от COVID-19, с протеомными различиями, которые мы обнаружили на протяжении многих лет у пациентов с шизофренией. Симптомы обоих состояний очень похожи. Психоз, самый классический признак шизофрении, также встречается у людей с COVID-19».

Цель исследования — выяснить, может ли заражение SARS-CoV-2 привести к дегенерации белого вещества головного мозга, состоящего в основном из глиальных клеток (астроцитов и микроглии) и аксонов (отростков нейронов). «Мы наблюдали значительное соответствие [в характере протеомных изменений], связанное с энергетическим метаболизмом и глиальными белками, которые, по-видимому, важны как при COVID-19, так и при шизофрении. Эти результаты, возможно, могут помочь в лечении психических симптомов COVID -19, — размышлял Мартинс-де-Суза.

Марсело Мори, профессор IB-UNICAMP и член Исследовательского центра ожирения и сопутствующих заболеваний (OCRC), исследование стало возможным только благодаря сотрудничеству исследователей с различным и дополняющим друг друга опытом и опытом. «Это демонстрирует, что первоклассная конкурентоспособная наука всегда междисциплинарна», — сказал он. «Трудно конкурировать на международном уровне, если вы остаетесь в своей собственной лаборатории, ограничиваясь методами, с которыми вы знакомы, и оборудованием, к которому у вас есть доступ».