Продолжающаяся пандемия коронавирусной болезни 2019 года (COVID-19) привела к гибели более 6,4 миллиона человек, и продолжают появляться новые случаи заболевания. Ожидалось, что в связи с широкомасштабной вакцинацией распространение вируса снизится. Возникновение прорывных инфекций и повторных инфекций доказало ошибочность этой надежды.

Новое исследование отображает ускользающие мутации, обнаруженные в различных штаммах коронавируса тяжелого острого респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2), которые могут привести к тому, что они избегают нейтрализации антителами или обнаружения с помощью экспресс-тестов на антигены, которые полагаются на связывание антител для получения положительного результата. .

Введение

Диагностические тесты на COVID-19 были запущены еще в апреле 2020 года с использованием отчетов in vitro с использованием вирусной последовательности наследственного варианта вируса, уханьского варианта. С появлением новых вариантов возникли вопросы о производительности этих тестов, поскольку они используют способность антител распознавать вирусные антигены и связываться с ними . Это распознавание нарушается в присутствии ускользающих мутаций.

В текущем исследовании, опубликованном в журнале Cell , представлен новый метод оценки влияния таких мутаций-мишеней N на распознавание антигена диагностическими антителами, используемыми в экспресс-тестах на антиген.

Экспресс-тесты на антигены помогают быстро и легко обнаружить наличие SARS-CoV-2. В большинстве случаев они используют вирусный нуклеокапсидный (N) антиген, который в изобилии присутствует в вирусных частицах, а также у инфицированных людей. Белок N играет ключевую роль в жизненном цикле вируса, включая репликацию и упаковку вируса. Он имеет РНК-связывающий домен (N-RBD) и домен димеризации (N-DD), вокруг которых расположены три неупорядоченных участка.

Антитела связываются с эпитопами, специфическими областями антигена, которые имеют структуру, комплементарную связывающему домену антитела. Картирование эпитопов — это область, в которой используются несколько методов, таких как определение структуры, масс-спектрометрия или сайт-направленный мутагенез, чтобы помочь идентифицировать сайты ускользающих мутаций на антигене. Однако ни один из методов, используемых в настоящее время, не может непосредственно измерить влияние данной мутации на связывание антител.

Многие исследователи обращаются к глубокому мутационному сканированию (DMS), методу, который исследует большинство или все мутации в белке с помощью библиотеки мутантов или уникальных последовательностей. Эти последовательности можно одновременно подвергать скринингу с использованием методов селекции in vitro для обогащения соответствующими мутациями.

При использовании вместе с методами отображения на клеточной поверхности DMS помог изучить взаимодействия шиповидных белков SARS-CoV-2 с рецептором ангиотензинпревращающего фермента 2 (ACE2) хозяина и ключевые мутации, которые нарушают связывание шиповидных антител на RBD шипа.

В текущем исследовании клетки млекопитающих используются для отображения на поверхности белка N для достижения прямого количественного анализа связывания антител. Сочетая это с DMS, используя библиотеку всех возможных аминокислотных замен по всей длине белка N, исследователи смогли провести полный анализ эффектов всех возможных мутаций на связывание антигена с 17 диагностическими антителами, которые в настоящее время используются для тестирования на этот вирус.  

Результатом является полная картина ускользающих мутаций, возможных для каждого антитела, с оценкой потенциала ускользания в каждой области. Баллы показывают, насколько распространена данная мутация в группе клеток, экспрессирующих ускользающие мутации. Таким образом, он показывает, насколько сильно каждая мутация влияет на связывание антител.

California Gold Nutrition, LactoBif, пробиотики, 30 млрд КОЕ, 60 вегетарианских капсул

Таким образом, балльные оценки помогают идентифицировать как эпитопы, так и чувствительность диагностического антитела к мутациям в эпитопе или рядом с ним. Данные помогают понять, как каждая мутация в этих сайтах влияет на распознавание антител. Таким образом измеряли силу связывания антитела по всей библиотеке мутационных последовательностей N с учетом каждой возможной точечной мутации.

Что показало исследование?

Как и ожидалось, большинство мутаций не снижают связывание антител, этот эффект ограничивается небольшим набором мутаций в четко определенных сайтах. Это включает эпитопы, связанные с антителами, такими как R040, C706 и 3C3. В первом случае любая мутация в трех различных положениях вызывает снижение связывания, но этот эффект вызывают только изменения заряженных или полярных аминокислот в другом положении.

Последние два являются примерами антител, связывающихся с 3D-эпитопами, где только несколько мутаций в значительной степени связаны с заметно сниженным связыванием антител. В 3C3 замена E323 почти всегда оказывает большое влияние, но не в V324, где только мутации в заряженных или ароматических аминокислотах вызывают снижение связывания.

В целом это показывает, что данный эпитоп чувствителен к некоторым заменам, но не к другим, и подчеркивает подробную информацию, доступную с этой платформой.

Любая мутация в трех сайтах в эпитопе R040 и четырех сайтах в эпитопе С706 отменяла связывание, но вне этих эпитопов мутации были незначительными. Интересно, что в случае 3C3 две мутации отменили связывание, а другая уменьшила аффинность связывания на 2 порядка. Четвертое имело только мягкий эффект, но два других антитела улавливали этот мутант при нормальных уровнях связывания.

Это указывает на то, что частичное неправильное сворачивание белка, вызванное последней мутацией, было недостаточным для снижения аффинности связывания с этими антителами. Для некоторых мутаций N-RBD также наблюдались долгосрочные эффекты связывания, что указывает на то, что связывание может снижаться без заметного изменения аффинности.

Исследование дало массу информации о том, где антитела связываются с белком N. Он демонстрирует, как различные антитела ускользают с помощью их характерных наборов ускользающих мутаций, помогая раскрыть основной механизм ускользания и позволяя различать антитела, даже когда они связываются с перекрывающимися эпитопами.

Экспресс-тесты на антигены работают на основе двух антител, одно в твердой фазе, а другое в подвижной фазе, причем оба должны связываться с антигеном для генерации сигнала. Интересно, что данные этого исследования показывают, что эти диагностические наборы антител связываются с разными эпитопами, поэтому маловероятно, что оба они будут иметь одинаковую высокую оценку ускользания в данной области N-белка. Это означает, что все антитела, используемые в этих тестах, могут связываться одновременно, что подтверждает надежность этих тестов.

В совокупности эти данные показывают, что DMS можно использовать для выбора подходящих пар антител при разработке новых тестов на антигены ».

Подразумеваемое

Полученные данные показывают ценность экспресс-тестов на антигены для выявления мутаций как в текущих, так и в более старых вариантах SARS-CoV-2. Известные в настоящее время мутации белка N вряд ли приведут к провалу теста.

Во-вторых, представляя результаты анализа связывания для всех возможных точечных мутаций, в том числе тех, которые могут возникнуть в будущем, они важны для дальнейшего отслеживания эволюции этого вируса и развития пандемии. Это имеет огромное значение для клинического и общественного здравоохранения.

Опять же, этот метод, сочетающий DMS с отображением поверхности клеток млекопитающих, превосходит текущий золотой стандарт картирования структурных эпитопов, поскольку он непосредственно оценивает распознавание полноразмерного антигена антителами при использовании библиотеки мутаций для измерения связывания с любой возможной мутацией.

Несмотря на то, что он не идентифицирует эпитоп напрямую, он обеспечивает характерный для антител отпечаток пальца ускользающей мутации. Это можно использовать более широко для изучения того, как антигенные мутации влияют на связывание антител. Его можно адаптировать для изучения белок-белковых взаимодействий в целом при условии, что можно разработать систему для экспрессии белков с обеих сторон.

Более того, это может помочь понять другие процессы, такие как созревание аффинности в зародышевых центрах В-клеток, включая увеличение аффинности антител по мере увеличения специфичности и устойчивости к антигенным мутациям.