Новый вариант системы редактирования генов CRISPR-Cas9 упрощает реинжиниринг большого количества клеток для терапевтических целей. Подход, разработанный в Институтах Гладстона и Калифорнийском университете в Сан-Франциско (UCSF), позволяет ученым вводить особенно длинные последовательности ДНК в точные места в геномах клеток с удивительно высокой эффективностью без систем доставки вирусов, которые традиционно использовались для переноса ДНК в клетки.

«Одна из наших целей на протяжении многих лет заключалась в том, чтобы поместить длинные инструкции ДНК в целевой участок генома таким образом, чтобы это не зависело от вирусных векторов», — говорит Алекс Марсон, доктор медицинских наук, директор Института Gladstone-UCSF. геномной иммунологии и старший автор нового исследования. «Это огромный шаг к следующему поколению безопасной и эффективной клеточной терапии».

В новой статье, опубликованной в журнале Nature Biotechnology , Марсон и его коллеги не только описывают технологию, но и показывают, как ее можно использовать для создания CAR — T-клеток с потенциалом для борьбы с множественной миеломой, раком крови, а также для перезаписи последовательности генов, мутации которых могут привести к редким наследственным иммунным заболеваниям.

«Мы показали, что можем сконструировать более одного миллиарда клеток за один прогон, что намного превышает количество клеток, необходимое для лечения отдельного пациента», — говорит первый автор Брайан Шай, доктор медицинских наук, научный сотрудник лаборатории Марсона. .

От двухцепочечной ДНК к одноцепочечной

CRISPR-Cas9, система, которая редактирует гены внутри живых клеток, использовалась в качестве основного исследовательского инструмента в течение последнего десятилетия. Все чаще многие ученые-клиницисты воодушевлены потенциалом CRISPR-Cas9 для создания терапии живыми клетками.

С помощью редактирования генов можно, среди прочего, отключить, удалить или заменить мутировавший ген, вызывающий заболевание, или повысить противораковую активность иммунной клетки. Хотя первые терапевтические применения CRISPR-Cas9 недавно прошли клинические испытания, технология все еще ограничена проблемой безопасного получения большого количества правильно отредактированных клеток.

Традиционно исследователи полагались на вирусные векторы — оболочки вирусов без их болезнетворных компонентов — для переноса ДНК (называемой матрицей ДНК), используемой для генной терапии, в клетки. Тем не менее, производство больших количеств вирусных векторов клинического качества было основным узким местом в обеспечении пациентов клеточной терапией. Кроме того, исследователи не могут легко контролировать, где традиционные вирусные векторы вставляют гены в геном.

«Использование вирусных векторов дорого и ресурсоемко», — говорит Шай. «Основное преимущество невирусного подхода к генной инженерии заключается в том, что мы не ограничены стоимостью, сложностью производства и проблемами цепочки поставок».

В 2015 году группа Марсона в сотрудничестве с лабораторией пионера CRISPR Дженнифер Дудна, доктора философии, впервые показала, что они могут вставлять короткие матрицы ДНК в иммунные клетки без вирусных векторов, используя электрическое поле, которое делает внешние мембраны клеток более проницаемыми. К 2018 году они разработали метод вырезания и вставки более длинных последовательностей ДНК в иммунные клетки с помощью CRISPR.

Enzymedica, Digest Gold + пробиотики, 90 капсул

Затем, в 2019 году, исследователи обнаружили, что, используя также модифицированную версию матриц ДНК, которые могут связываться с ферментом Cas9 — тем же белком, который действует как молекулярные ножницы во время редактирования генов CRISPR, — они могут доставлять новые последовательности в целевой сайт генома более эффективно.

Однако потребовалась дополнительная работа, чтобы увеличить выход успешно сконструированных иммунных клеток и сделать процесс совместимым с производством будущих клеточных методов лечения. Эти цели мотивировали текущее исследование команды.

ДНК может существовать в виде одиночных или двойных цепей (как противоположные части липучки), и Cas9 присоединяется к двухцепочечной ДНК. Исследователи быстро обнаружили, что высокие уровни двухцепочечной ДНК-матрицы могут быть токсичными для клеток, поэтому метод можно было использовать только с небольшим количеством матричной ДНК, что приводило к низкой эффективности.

Команда знала, что одноцепочечная ДНК менее токсична для клеток даже при относительно высоких концентрациях. Итак, в новой статье они описывают метод присоединения модифицированного фермента Cas9 к одноцепочечной матричной ДНК путем добавления лишь небольшого выступа двухцепочечной ДНК на концах.

«Это дает нам сбалансированный подход, сочетающий в себе лучшее из двух миров», — говорит Марсон.

Одноцепочечная матричная ДНК может более чем удвоить эффективность редактирования генов по сравнению со старым двухцепочечным подходом. А двухцепочечные концы молекул позволяют исследователям использовать Cas9 для улучшения доставки невирусных векторов в клетки.

«Эта технология может сделать новые клеточные и генные методы лечения быстрее, лучше и дешевле», — говорит Джонатан Эсенстен, доктор медицинских наук, автор новой работы, доцент кафедры лабораторной медицины в Калифорнийском университете в Сан-Франциско и аффилированный исследователь. в Гладстоне.

Путь в клинику

В ходе исследования ученые использовали новую матрицу ДНК для создания более миллиарда CAR-T-клеток, нацеленных на множественную миелому. CAR-T-клетки представляют собой иммунные Т-клетки, генетически модифицированные для эффективной борьбы с определенными клетками или раком. С новыми одноцепочечными матрицами, направленными Cas9, примерно половина всех Т-клеток получила новый ген и в результате была преобразована в CAR-T-клетки.

Мы знали, что нацеливание матриц ДНК на определенное место в геноме, называемое сайтом TRAC, улучшит противоопухолевую активность CAR-T-клеток. Этот новый невирусный подход позволяет нам гораздо более эффективно добиваться этого, что ускорит разработку следующего поколения CAR-T-клеточной терапии».

Джастин Эйкем, доктор философии, соавтор новой статьи, доцент кафедры гематологии и онкологии Калифорнийского университета в Сан-Франциско и аффилированный исследователь в Гладстоне.

Кроме того, исследователи показали, что их подход может впервые полностью заменить два гена, связанных с редкими генетическими иммунными заболеваниями, гены IL2RA и CTLA4 .

В прошлом ученые показали, что они могут заменить небольшие участки гена IL2RA , в которых у конкретных пациентов есть мутации. Теперь команда Марсона доказала, что они могут заменить сразу все гены IL2RA и CTLA4 — подход «один размер подходит всем», который может лечить многих пациентов с различными мутациями в этих генах, вместо того, чтобы создавать персонализированные шаблоны для мутации каждого пациента. . Почти 90 процентов клеток, обработанных с помощью этого генно-инженерного подхода, получили здоровые версии генов.

В настоящее время исследователи ищут одобрение для продвижения клинических испытаний с использованием невирусной технологии CRISPR как для CAR-T-клеточной терапии, так и для лечения дефицита IL2RA.