В недавнем исследовании, опубликованном на сервере препринтов bioRxiv *, исследователи оценили влияние нацеливания на внутриклеточный Neu1 на инфекцию коронавируса тяжелого острого респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2). 

Существует острая необходимость в разработке методов лечения коронавирусной болезни 2019 (COVID-19) и противовирусных препаратов против SARS-CoV-2. Кроме того, исследования показывают, что новые мутации SARS-CoV-2 менее устойчивы к современным вакцинам. Поэтому для создания терапевтических препаратов жизненно важно понимать механизмы патогенности SARS-CoV-2 и реакцию хозяина.

Об исследовании

В настоящем исследовании исследователи продемонстрировали, что хозяин Neu1 контролирует сиалирование нуклеокапсидного белка коронавируса, тем самым регулируя репликацию коронавируса.

Команда использовала масс-спектрометрию для изучения N- и O-гликанов на белке нуклеокапсида (N) человеческого коронавируса OC43 (HCoV-OC43), бета-коронавируса, вызывающего легкие респираторные симптомы. Лектиновый блот проводили с использованием образцов, иммунопреципитированных из сыворотки инфицированных SARS-CoV-2 пациентов и здоровых контролей, а также лизатов клеток, инфицированных HCoV-OC43 и обработанных антителами против белка N.

Лектиновый блот установил, произошло ли сиалирование белка N, соответствующего коронавирусам HCoV-OC43 и SARS-CoV-2. Иммунопреципитированные образцы либо подвергали, либо не подвергали обработке сиалидазой перед разделением с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE).

Команда исследовала, как сиалирование белка N может повлиять на его способность связывать рибонуклеиновую кислоту (РНК). Тесты на связывание нуклеиновых кислот проводили с 32-членной одноцепочечной РНК (оцРНК) с мотивом «стебель-петля II» (32m) и ее 32-мерным аналогом ss-дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) для оценки аффинности связывания нуклеиновых кислот N белок. Клетки HEK293T лизировали через 48 часов после трансфекции вектора экспрессии белка N SARS-CoV-2.

Затем клетки вводили с сиалидазой или без нее для экспериментов по связыванию нуклеиновых кислот. Используя клеточные линии THP-1, команда оценила роль эндогенных сиалидаз в сиалилировании N-белка.

NutriBiotic, Immunity, аскорбат натрия, кристаллический порошок, 454 г (16 унций)

Команда оценила, как сиалирование может повлиять на репликацию вируса. Количественную полимеразную цепную реакцию в режиме реального времени (RT-qPCR) использовали для измерения вирусной инфекции с использованием праймеров, нацеленных на кодирующую область вирусного гена N. После заражения вирусом в установленное время собирали клеточную РНК и измеряли вирусные транскрипты. Кроме того, супернатанты подвергали обработке для анализа инфекционной дозы 50% культуры ткани (TCID50), который использовали для измерения титра вируса.

Полученные результаты

Результаты исследования показали, что, хотя гликозилирование N- и O-связей наблюдалось в системе сверхэкспрессии N-белка in vitro , неясно, является ли N-белок из вириона гликозилированным или нет. Белки шипа (S), оболочки (E) и мембраны (M) SARS-CoV-2 гликозилированы. Белок N был значительно сиалилирован в клетках пациентов, инфицированных как COVID-19, так и HCoV-OC43. Большая часть сиаловой кислоты на белке N была присоединена к альфа-2, 6 связям, в то время как обработка сиалидазой подтверждала сиалирование белка N. Белок N SARS-CoV-2, экспрессированный в клетках HEK293T, белок HCoV-OC43-N, экспрессированный в клетках THP-1, и вирион HCoV-OC43 оказались сиалированными.

В присутствии антител против N-белка N-белок SARS-CoV-2 образовывал мощный комплекс с 32-мерной оцРНК и 32-мерной оцДНК, который подвергался суперсдвигу, демонстрируя, что этот комплекс является эксклюзивным для N-белка. Как и ожидалось, лизаты клеток HEK293T, трансфицированных пустым вектором, не смогли связать 32-мерные оцРНК и оцДНК. Кроме того, количество 32-мерных оцДНК и оцРНК, связанных с N-белком, после обработки сиалидазой значительно возрастало. Эти результаты подтвердили решающую роль сиалирования N-белка в связывании РНК, продемонстрировав значительное увеличение активности связывания N-белка с РНК после обработки сиалидазой.

После заражения HCoV-OC43 в течение 72 часов экспрессия Neu1 была значительно повышена, но не Neu2, Neu3 или Neu4, согласно ПЦР в реальном времени и вестерн-блоттингу. Примечательно, что у пациентов с COVID-19 также была активизирована Neu1. Кроме того, в клетках, инфицированных HCoV-OC43, белок N был связан с Neu1.

Через два дня после заражения вирусом репликация HCoV-OC43 была более чем в 10 раз выше в супернатантах клеточных культур клеток, которые сверхэкспрессировали Neu1, по сравнению с клетками, которые экспрессировали пустые векторы на уровне вирусных транскриптов и вирусных титров. Напротив, репликация HCoV-OC43 была более чем в 100 раз ниже в клетках, которые сверхэкспрессировали короткую шпилечную РНК (кшРНК) для Neu1, чем те, которые экспрессировали скремблированную кшРНК, как с точки зрения вирусных транскриптов, так и вирусных титров.

В соответствии с эффективностью нокдауна кшРНК, Neu1sh3 резко снижал репликацию HCoV-OC43 в большей степени, чем это делали Neu1sh1 и Neu1sh2. Уровни белка N также были заметно выше в клетках со сверхэкспрессией Neu1, чем в клетках с нокдауном Neu1. Эти данные свидетельствуют о том, что хозяин Neu1 контролирует репликацию HCoV-OC43 в клетках THP-1. Наиболее эффективную защиту обеспечивал Neu5Ac2en-OAcOMe, в то время как ингибиторы вирусной нейраминидазы Занамивир и осельтамивир проявляли небольшую ингибирующую активность. Эти результаты подтверждают более ранние сообщения о том, что занамивир и осельтамивир обладают слабой активностью против сиалидаз человека.

Заражение HCoV-OC43 привело к гибели всех мышей, получавших носитель, но только 50% животных, получавших Neu5Ac2en-OAcOMe, выжили за весь период наблюдения. По сравнению с мышами, получавшими Neu5Ac2en-OAcOMe, мыши, получавшие носитель, имели значительно меньшую массу тела. Мыши, получавшие Neu5Ac2en-OAcOMe, также снижали репликацию вируса HCoV-OC43 в крови, головном мозге и легких.

Результаты исследования показали, что недавно разработанный ингибитор сиалидазы, Neu5Ac2en-OAcOMe, избирательно нацеливался на внутриклеточную сиалидазу хозяина Neu1 и подавлял репликацию коронавируса, учитывая роль хозяина, а также патогена в проявлении заболевания.

*Важное замечание

bioRxiv публикует предварительные научные отчеты, которые не рецензируются экспертами и, следовательно, не должны рассматриваться как окончательные, направляющие клиническую практику/поведение, связанное со здоровьем, или рассматриваться как установленная информация.