В недавнем исследовании, опубликованном в журнале Frontiers in Microbiology , исследователи разработали RK-33, низкомолекулярный ингибитор DDX3, и оценили его эффективность против вызывающих озабоченность вариантов коронавируса тяжелого острого респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2).

Постоянное появление летучих органических соединений SARS-CoV-2 привело к увеличению случаев заболевания коронавирусом 2019 (COVID-19) во всем мире, несмотря на эффективность вакцин против COVID-19. Появляющиеся ЛОС обладают более высокой трансмиссивностью и иммунитетом, чем предыдущие ЛОС, что обуславливает необходимость разработки агентов против SARS-CoV-2 для расширения терапевтического спектра COVID-19 и снижения бремени COVID-19.

Белки-хозяева, необходимые для репликации SARS-CoV-2, могут быть нацелены на разработку новых лекарств в качестве альтернативы или дополнения к вакцинам. Исследования показали, что DDX3 требуется SARS-CoV-2 для производства вириона и является частью интерактома SARS-CoV-2. Следовательно, молекулы, ингибирующие DDX3, потенциально могут быть эффективны против SARS-CoV-2.

Об исследовании

В настоящем исследовании исследователи оценили эффективность RK-33 против SARS-CoV-2.

Клетки Calu-3 (линия клеток рака легкого) использовались с нетоксичными дозами RK-33 для экспериментов с клеточными культурами и изолятами SARS-CoV-2, такими как линия A (эталон), линия B, бета-ЛОС, альфа-ЛОС и , Delta VOC использовали для анализов. Выполняли анализ жизнеспособности клеток и определяли значения 50% цитотоксической концентрации (CC 50 ).

Для оценки вирусных титров проводили анализы бляшек и определяли средние значения эффективной концентрации (EC 50 ). РНК SARS-CoV-2, выделенная из клеточных лизатов, содержащих SARS-CoV-2, была подвергнута анализу секвенирования рибонуклеиновой кислоты (РНК) (RNA-seq). Кроме того, гены РНК-зависимой РНК-полимеразы (RdRp) и оболочки (E) SARS-CoV-2 были амплифицированы из РНК с помощью количественного анализа полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (RT-qPCR) для оценки числа копий, а также был проведен протеомный анализ. .

Последовательности белков для белков SARS-CoV-2 (n = 25) были извлечены из последовательностей генома изолятов SARS-CoV-2, и для каждого белка был проведен анализ множественного выравнивания последовательностей (MSA). Были отмечены различия, касающиеся линии А, и оценены эволюционные расстояния белков. Команда получила трехмерные (3D) модели тримеров белка шипа (S) линии A в закрытой и открытой конформациях с белковыми последовательностями, аналогичными последовательностям белка линии A, используемым в настоящем исследовании, и визуализировала Alpha VOC, Beta VOC и Delta VOC. вариации трехмерных структур.

Полученные результаты

Fungi Perfecti, Host Defense, гриб кордицепс, поддержка выработки энергии, 60 вегетарианских капсул

Нацеливание на DDX3 с помощью RK-33 снизило вирусную нагрузку изолятов линии A, B линии B Alpha, Beta и Delta изолятов SARS-CoV-2 на один log до трех log в клетках Calu-3. Кроме того, лечение RK-33 снижало выработку внутриклеточной РНК SARS-CoV-2 на 2,5–3,0 log10, как показал анализ RT-qPCR. Полученные данные показали, что RK-33 продемонстрировал сильное действие против SARS-CoV-2 в отношении всех протестированных вирусных изолятов.

Кроме того, протеомный анализ и анализ РНК-секвенций показали, что RK-33 подавляет большинство генов SARS-CoV-2 [S, E, мембрана (M), нуклеокапсид (N), открытые рамки считывания (ORF) 1ab, 3a, 7a, 7б, 8 и 10]. Кроме того, RK-33 снижал экспрессию трансмембранной сериновой протеазы 2 ( TMPRSS2 ) на 50% в течение двух дней, возможно, из-за способности DDX3 раскручивать структуры G-квадруплекса, присутствующие в TMPRSS2.

Все образцы содержали 45 миллионов прочтений; однако анализ MSA показал, что зараженные вирусом клетки Calu-3 показали 33% уникальных совпадений генома человека по сравнению с другими образцами (88%). Это было важным открытием, поскольку неструктурный белок 1 (Nsp1) дегенерирует РНК клетки-хозяина, чтобы сделать возможным захват клеток-хозяев SARS-CoV-2. Реверсия РНК SARS-CoV-2 в РНК клетки-хозяина среди клеток, обработанных RK-33, и клеток, инфицированных SARS-CoV-2, подчеркнула важность RK-33 для нацеливания на DDX3.

Большинство белков SARS-CoV-2 (P0DTC3 ORF3a, P0DTC2 S, P0DTC9 N, P0DTC5 M, полипротеин репликазы P0DTD1 1ab, P0DTC8 ORF8, aP59595 N и P0DTD2 ORF9b) показали значительную активацию (>7,5 FC) в клетках Calu-3. после инфекции SARS-CoV-2 и значительное снижение активности после терапии RK-33.

Пять основных значительно обогащенных механизмов после инфекций SARS-CoV-2 включают (i) интерферон-альфа/бета (передача сигналов IFN α/β, (ii) противовирусные механизмы, стимулированные IFN-геном 15 (ISG15), (iii) SARS-CoV -2 трансляция мРНК, (iv) зависимое от сигнальных частиц (SRP) нацеливание ко-трансляционных белков на мембраны и (v) удлинение пептидных цепей.

После терапии RK-33 наблюдался сдвиг в затронутых путях, при этом пять основных значительно обогащенных механизмов включали (i) митохондриальную (mt) инициацию трансляции, (ii) элонгацию трансляции mt, (iii) терминацию трансляции mt, (iv) презентация антигена [включая фолдинг, сборку и загрузку главного комплекса гистосовместимости (MHC) класса I] и (v) SRP-зависимое нацеливание котрансляционных белков на мембрану.

Запросив базу данных STRING, команда обнаружила, что определенные механизмы среди клеток, обработанных RK-33, были положительно обогащены (эндосомные/вакуолярные пути и регуляция каскада комплемента). Наоборот, некоторые пути были обогащены отрицательно (трансляция мт и инициация трансляции мт). Полученные данные показали, что низкомолекулярный ингибитор подавлял выработку белка SARS-CoV-2, и эти изменения соответствовали изменениям протеома хозяина, особенно в отношении врожденных иммунологических путей.

Кроме того, 1 мкМ RK-33 снижал титры человеческого коронавируса (HCoV)-OC43 более чем в 2 логарифма или более чем в 100 раз. Установленные значения CC 50 и EC 50 среди клеток Calu-3 составляли 13,5 мкМ и < 1 мкМ, что приводило к индексу селективности (CC 50 / EC 50 ) 14,5.

В целом, результаты исследования показали, что RK-33 можно использовать в качестве эффективного терапевтического средства против SARS-CoV-2 для устранения функций хозяина DDX3 и ограничения передачи новых летучих органических соединений SARS-CoV-2.