В недавнем исследовании, опубликованном в PLOS Pathogens , исследователи проверили библиотеку фагов, кодирующих биосинтетические белки, называемые αReps. Они преследовали αReps, которые могли бы блокировать взаимодействие между рецептор-связывающим доменом (RBD) шиповидного белка (S) коронавируса тяжелого острого респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2) с рецепторами ангиотензинпревращающего фермента 2 (ACE2) хозяина.

Фон

Крайне важно разработать эффективные противовирусные стратегии против SARS-CoV-2, чтобы смягчить и контролировать кризис коронавирусной болезни 2019 (COVID-19), который уже привел к более чем шести миллионам смертей во всем мире. Стратегия борьбы с распространением всех респираторных вирусов также необходима для борьбы с будущими пандемиями.

SARS-CoV-2 инициирует инфекцию в носовой полости, размножается в обонятельном эпителии и нижних дыхательных путях (ВДП), а затем достигает нижних дыхательных путей (НВД), где вызывает инфекцию. Поскольку он вызывает массивное повреждение обонятельного эпителия, противовирусное блокирование размножения вируса в носу и ВДП может принести огромную терапевтическую пользу и даже обеспечить профилактическую защиту.

Некоторые человеческие нейтрализующие моноклональные антитела иммуноглобулина G (IgG) ингибируют инфекцию SARS-CoV-2 в носу и ВДП; однако их использование ограничено. Кроме того, их стойкость при распылении и распылении является плохой. Они требуют инъекций и не могут приниматься перорально или в виде спрея.

αReps представляют собой длинные термостабильные белки, состоящие из 31 аминокислоты (АА), обычно встречающиеся у эукариот и прокариот, включая термофилов. Последовательности гомологичных αReps образуют контрастный профиль последовательности, при этом большинство позиций занимают консервативные АК, а оставшиеся позиции образуют гибкую поверхность связывания. Ученые собрали массивную библиотеку αRep с обширным набором разрозненных белков-мишеней, в частности, для взаимодействия и вредоносного вмешательства в созревание вируса (например, против нуклеокапсидного белка вируса иммунодефицита человека).

Белок шипа (S) SARS-CoV-2, как и белки S всех коронавирусов , содержит RBD. RBD является мишенью для идентификации лигандов, которые блокируют взаимодействие с рецепторами клетки-хозяина. Однако эволюция SARS-CoV-2 привела к появлению явных ускользающих мутаций в RBD, что сделало текущие методы лечения на основе антител тяжелой цепи (VHH) гораздо менее эффективными.

Об исследовании

В настоящем исследовании исследователи разработали серию αRep, специфичную для RBD вируса SARS-CoV-2 S, которую можно легко адаптировать для стабильной работы против вариантов SARS-CoV-2 при низких затратах. Исследователи использовали ранее установленный метод для создания библиотеки αRep, основанный на полимеризации синтетических микрогенов, соответствующих отдельным HEAT-подобным повторам. Они использовали поверхность нитчатых фагов, происходящих из M13, для экспрессии белков αRep.

Они клонировали гены αRep, кодирующие связыватели RBD, в бактериальном векторе экспрессии pQE81 и использовали полученные плазмиды для трансформации клеток Rosetta. По оценкам, библиотека содержала 1,7×10 9 независимых клонов.

Кроме того, исследователи провели эксперименты по кинетике связывания и использовали интерферометрию биослоя для определения сродства. Кроме того, они провели анализы конкуренции между αRep с использованием биотинилированного RBD SARS-CoV-2, загруженного биосенсорами на основе стрептавидина (SA).

Результаты исследования

αReps C2 и F9 демонстрировали сродство RBD к SARS-CoV-2 в наномолярном (нМ) диапазоне. Гетеродимер F9-C2 и гомотримерный C2-фолдон показали более высокую нейтрализующую активность в отношении SARS-CoV-2, чем исходные αReps. Они проявляли полумаксимальную ингибирующую концентрацию (IC 50 ) от трех до 12 нМ.

Более того, F9-C2 и C2-фолдон помогли эффективно нейтрализовать широкий спектр вариантов SARS-CoV-2, включая Omicron. Эта особенность может быть связана с присущей субъединицам αRep высокой аффинностью к RBD и их мультимеризацией, что делает возможной меньшую зависимость от замен AA в мишени.

Анализы конкурентного связывания показали, что αReps нейтрализуют SARS-CoV-2 с помощью различных механизмов, при этом C2 связывается с сайтом, удаленным от мотива связывания рецептора с ACE2 и перекрывающимся с эпитопом VHH H11D4. Напротив, F9 конкурировал с ACE2 и VHH-72 за связывание RBD. В модели хомяков лечение C2 и F9 αReps вызывало снижение вирусной нагрузки в носу (первичный сайт репликации SARS-CoV-2), а также снижение всех воспалительных маркеров инфекции.

Выводы

Благодаря оптимизации выбора связующего и усилиям по стабилизации αRep в полости носа эти биосинтетические белки и их производные могут стать многообещающими и универсальными нейтрализующими связующими, нацеленными на S-белок SARS-CoV-2. Они также могут быть недорогим потенциальным средством лечения новых респираторных вирусов. Однако будущие исследования должны решить вопросы иммуногенности αReps. Примечательно, что они имеют относительно небольшой размер (например, C2 αRep составляет 18,5 кДа), следовательно, их высокая растворимость, стабильность и ассоциация через гибкие линкеры обусловливают низкую иммуногенную активность, что, в свою очередь, затрудняет индукцию побочных эффектов при доставляется в полость носа.