В недавнем исследовании, опубликованном на сервере препринтов bioRxiv *, исследователи выполнили фотокаталитическое картирование взаимодействия белка-шипа коронавируса 2 тяжелого острого респираторного синдрома (SARS-CoV-2) с мембраной клетки-хозяина.

Понимание проникновения вируса и патогенности может быть улучшено путем определения мест обитания белка на границе раздела вирус-клетка-хозяин. Вирус, ответственный за продолжающуюся пандемию коронавирусной болезни 2019 (COVID-19), SARS-CoV-2, использует белок ангиотензинпревращающий фермент-2 (ACE2) в качестве основного рецептора. Однако роль других клеточных белков в процессе входа неясна.

Об исследовании

В настоящем исследовании команда разработала технологию картирования микроокружения белка-хозяина вируса (ViraMap) с использованием иридиевых фотокатализаторов (IrPC), конъюгированных с шиповидным белком SARS-CoV-2, для маркировки близости клеток-хозяев, управляемой видимым светом.

Команда создала фотокаталитические конъюгаты шиповидных белков для целевого мечения клеток, экспрессирующих ACE2, для анализа взаимодействий в микроокружении поверхности клеток-хозяев SARS-CoV-2 с шипами с использованием ViraMap. Тример белка шипа SARS-CoV-2 и его ассоциированные варианты, включая шип SARS-CoV-1 и шип SARS-CoV-2 D614G, были выбраны для конъюгации с IrPC.

Кроме того, исследователи выполнили целевое мечение клеток, подвергнув их конъюгатам шип-IrPC в присутствии биотин-диазиринового зонда. За этим последовало облучение синим светом и последующий мониторинг с помощью проточной цитометрии и анализа конфокальной визуализации. Чтобы избирательно пометить контакты на поверхности клетки-хозяина и избежать клеточной интернализации конъюгатов шип-IrPC, клетки HEK293T + ACE2 обрабатывали шипом-IrPC при 4 ° C.

Команда оценила связывание клеточной поверхности в присутствии свободного белка ACE2, чтобы установить, что соединение шип-IrPC сохраняет свою аффинность к ACE2 (ACE2-Fc). Для маркировки близости клеточной поверхности на клетках HEK293T + ACE2 использовались три шиповидных варианта IrPC, такие как шиповидные белки SARS-CoV-1, SARS-CoV-2 и SARS-CoV-2 D614G .

California Gold Nutrition, LactoBif, пробиотики, 30 млрд КОЕ, 60 вегетарианских капсул

Кроме того, команда использовала комбинацию первичных и вторичных антител, содержащую первичное антитело против ACE2 и конъюгат антитело-фотокатализатор для целевого мечения. После экстракции из фракции клеточных мембран и обогащения стрептавидином биотинилированные белки-хозяева из этих целевых исследований мечения были количественно охарактеризованы с использованием количественной оценки жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (ЖХ-МС)/МС на основе тандемной масс-метки (ТМТ).

Полученные результаты

По сравнению с контрольным несвязывающим антителом иммуноглобулина G (IgG), конъюгированным с IrPC, анализ методом проточной цитометрии выявил четкое изменение сигнала биотинилирования для клеток, обработанных конъюгатами шиповидного варианта IrPC. По сравнению с контролем мыши-IgG-IrPC, конфокальная визуализация мечения, индуцированного шипом-IrPC, выявила локализацию биотина в окружающей среде на поверхности клетки-хозяина. Кроме того, поскольку рекомбинантная шиповидная конструкция имеет поли-His-метку, клеточное биотинилирование может быть достигнуто за счет направленного мечения конъюгатом IrPC антитела против His.

IrPC-конъюгированные шиповидные белки D614G SARS-CoV-1, SARS-CoV-2, SARS-CoV-2, а также системы первичных/вторичных антител против ACE2 привели к статистически значимому обогащению отдельных групп клеточных белков по сравнению с IrPC. изотип конъюгата в качестве отрицательного контроля. Используя алгоритмы оценки SAINTexpress и статистики взаимодействия масс-спектрометрии (MiST), команда идентифицировала 96 высоконадежных обогащенных белков во всех исследованиях мечения Spike-IrPC.

Почти 23 из 96 высоконадежных обогащенных белков были общими для всех трех вариантов шипа, тогда как оставшиеся два, 25 и 46 обогащенных белков были уникальными для SARS-CoV-1, SARS-CoV-2 и SARS-CoV-1. 2 шипа D614G-IrPC соответственно. Анализ обогащения генной онтологии 23 обогащенных белков обнаружил значительную связь с проникновением вируса, за которым следует дифференцировка иммунных клеток и костимулирующая активность. Кроме того, 70% обогащенных белков имело высокое содержание в большинстве тканей человека, включая легкие, почки, желудочно-кишечный тракт, жир, сердечную мышцу, мягкие ткани, репродуктивные ткани и мозг.

Из 23 в общей сложности 10 высоконадежных обогащенных белков можно было разделить на две группы в зависимости от того, показали ли они совместное обогащение с системой первичных/вторичных антител против ACE2. Первый класс рецепторов клеточной поверхности включал ACE2, нейропилин 1 (NRP1), отрицательный рецептор простагландина F2 (PTGFRN) и белок-гомолог 2 нейрогенного локуса Notch (NOTCH-2). Доказательства экспрессии белка PTGFRN и информационной рибонуклеиновой кислоты (мРНК) в широком спектре клеток тканей, особенно в кардиомиоцитах и ​​фибробластах легких, указывают на то, что эти типы клеток очень восприимчивы к SARS-CoV-2 через различные точки проникновения. Галектины были вторым набором белков-хозяев, обнаруженных во всех трех анализах мечения шип-IrPC.

Результаты экспериментов по целевому мечению указывают на предполагаемые корецепторы клеточной поверхности, участвующие в проникновении вируса и противовирусном иммунитете. В результате были проведены функциональные эксперименты для оценки того, какие из идентифицированных белков-хозяев участвуют во входе SARS-CoV-2 в клетки. Для функциональной проверки исследование было сосредоточено на десяти перекрывающихся белках, общих для всех трех вариантов шип-IrPC. Сгруппированные регулярно расположенные короткие палиндромные повторы / Cas9-опосредованный нокдаун (KD) снижали содержание ACE2 только на 30%. Хотя наблюдалось 40%-ное снижение экспрессии белка по сравнению с контролем, не было значительного изменения входа псевдочастиц после NRP1 KD.

В целом, результаты исследования показали, что технология ViraMap успешно облегчает оценку известных, а также неизвестных взаимодействий вирус-белок-хозяин, которые происходят на внешней клеточной мембране клетки-хозяина, с использованием методов нацеливания на распознавание клеточной поверхности.

*Важное замечание

bioRxiv публикует предварительные научные отчеты, которые не рецензируются экспертами и, следовательно, не должны рассматриваться как окончательные, направляющие клиническую практику/поведение, связанное со здоровьем, или рассматриваться как установленная информация.