В недавнем исследовании, опубликованном на сервере препринтов bioRxiv * , исследователи исследовали активность белка оболочки (E) коронавируса тяжелого острого респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2) с точки зрения катионов кальция (Ca2 + ).

Функциональные ионные каналы имеют решающее значение в инфекционных циклах некоторых вирусов, поскольку вирусы изменяют ионный баланс хозяина (особенно Са2 + ), чтобы облегчить их поглощение, созревание и экспорт. Виропорины, закодированные в вирусных геномах, необходимы для изменения ионного и клеточного гомеостаза. SARS-CoV-2 E образует ионные каналы в мембранах эндоплазматического ретикулума (ER)-промежуточного компартмента Гольджи (ERGIC) в связи с вирулентностью SARS-CoV-2 и прогрессированием инфекции.

Исследования показали, что блокада, делеция или мутации с потерей функции в белках E CoV могут генерировать аттенуированные или неспособные к размножению варианты вируса; однако точные физиологические функции SARS-CoV-2 E недостаточно хорошо охарактеризованы и требуют дальнейших исследований.

Об исследовании

В настоящем исследовании исследователи изучили основную физиологическую функцию SARS-CoV-2 E при вирусной инфекции.

Конструкцию белка Е, содержащую полноразмерную последовательность Е или остатки с 1 по 75 (EFL), получали, очищали от телец включения E. coli и восстанавливали в мембранах из фосфатидилэтаноламина (РЕ) в условиях фиксации напряжения. Олигомеры EFL были образованы и подтверждены вестерн-блоттингом и масс-фотометрией (МП).

Было выполнено молекулярно-динамическое (МД) моделирование, и были записаны электрофизиологические измерения с фиксацией напряжения для количественной оценки активности Ca2 + канала. Были исследованы связанная с мембраной структура и функциональная активность ионных каналов вируса SARS-CoV-2 E. Выполняли пентамеризацию EFL и подтверждали эксклюзионной хроматографией в сочетании с анализом многоуглового светорассеяния (SEC-MALS).

Кроме того, влияние посттрансляционных модификаций (ПТМ) на функцию белка Е исследовали путем пальмитоилирования всех остатков цистеина (Cys40, Cys43, Cys44) в каждой субъединице пентамеров EFL белковых каналов E SARS-CoV-2. Кроме того, оценивали влияние концентрации Ca2+ в просвете на свойства ворот EFL.

Группа исследовала, образует ли трансмембранный (TM) сайт функциональные субструктуры EFL, для которых был получен ETM, содержащий остатки вирусного белка E с 8 по 38, с помощью твердофазного пептидного синтеза, и оценила функциональность ETM in vitro . Команда исследовала, был ли ETM вставлен в плоские липидные бислои PE в условиях фиксации напряжения, и выполнила моделирование MD на доменах ETM в собранных пентамерах.

Полученные результаты

SARS-CoV-2 E образовывал проницаемые для Са2 + ионные каналы в плоских липидных бислоях, которые зависели от гидрофобных ворот и липидов. Вирусный белок Е обнаруживает связывающее кольцо для ионов Са2 + на входе в поры просвета, что стабилизирует поры в открытом состоянии. В результате катионы кальция увеличивали продолжительность открытых пор и ионные токи, проходящие через ионные каналы белка Е.

Активность гидрофобно управляемых ионных каналов вирусного белка Е и виропоринов регулировалась повышенными концентрациями Ca2 + в просвете (от 0,1 мМ до 1,0 мМ), электрохимическими градиентами, рН, ПТМ, фосфолипидами ERGIC с отрицательными зарядами и напряжением, приложенным к мембранам. Пальмитоилирование ≥1 остатка цистеина способствует образованию открытых и стабильных пор белка Е. Ионы Са2 + активировали просветные каналы ЭР и поддерживали поры в открытом состоянии.

Взаимодействия остатков Ca2 + -Glutamic изменяют конформацию белка E и способствуют открытию ионных каналов и потоку ионов в каналы и через них. Отличительный участок связывания кальция в Е-каналах служил областью рекрутирования ионов и местом активации в порах. Результаты анализа SEC-MALS и MP показали, что пентамеры EFL были преобладающими состояниями конструкции белка E. Белок Е показал катионную селективность по сравнению с анионами, при этом проницаемость для Cl составляет одну треть от проницаемости для Na + .

Используя Ca2 + в качестве проникающего катиона, команда наблюдала множественное включение каналов и частые, но короткие события открытия нескольких открытых состояний и более высокую проницаемость виропорина для ионов Na + , чем для ионов Ca2 + . Эксперименты с напряжением показали, что белок E, скорее всего, представляет собой потенциалзависимую пору, регулируемую электросмачиванием, и гидрофобный мотив (включающий остатки Phe20, 23 и 26), расположенный в центре поры.

Домен TM сам по себе не образует физиологически функциональных субструктур вирусного белка E. Следовательно, доменные конструкции могут быть неподходящими моделями для понимания функции и структуры вирусного белка Е для разработки препаратов против SARS-CoV-2. Высвобождение Ca2 + через поры вирусного белка E сильно зависело от нагрузки Ca2+ и истощения запасов Ca2+ ниже порогового значения, или модуляция области связывания положительных ионов могла отменить опосредованный SARS-CoV-2 E- поток Ca2 + . Это открытие имеет решающее значение, учитывая доказательства нарушения регуляции ионов кальция в клетках при коронавирусной болезни 2019 года (COVID-19).

В целом, результаты исследования подчеркивают физиологическую роль SARS-CoV-2 E, связанную с высвобождением Ca2 + из ER, и то, что характерная область активации Ca2 + может быть потенциально нацелена на разработку средств против CoV на основе механизмов блокировки ионных каналов. Полученные данные выявили новые участки взаимодействия ионов и липидов на вирусе SARS-CoV-2 E, которые могут стать мишенью для разработки препаратов против SARS-CoV-2, потенциально предотвращающих фатальную избыточную стимуляцию иммунных ответов хозяина и воздействуя на часть, наименее подверженную замене аминокислот. протеома SARS-CoV-2.

*Важное замечание

bioRxiv публикует предварительные научные отчеты, которые не рецензируются экспертами и, следовательно, не должны рассматриваться как окончательные, направляющие клиническую практику/поведение, связанное со здоровьем, или рассматриваться как установленная информация.