В недавнем исследовании, опубликованном на сервере препринтов bioRxiv *, исследователи провели анализ ProP-PD (протеомный пептидный фаговый дисплей) для выявления пептидов из областей протеома человека (хозяина) с внутренней неупорядоченностью, которые связываются с коронавирусом 2 тяжелого острого респираторного синдрома (SARS-CoV). -2) домены свернутых белков (PD), кодируемые геномом.

С тех пор, как началась пандемия коронавирусной болезни 2019 года (COVID-19), были проведены исследования для оценки взаимодействия белка SARS-CoV-2 с хозяином с помощью таких методов, как масс-спектроскопия (МС), и для выявления потенциальных противовирусных агентов. В качестве противовирусных средств можно использовать препараты, которые могут ингибировать репликацию SARS-CoV-2 путем нацеливания на протеазы и рибонуклеиновую кислоту (РНК)-зависимую РНК-полимеразу или генерировать антитела против шиповидного (S) белка SARS-CoV-2; однако необходимо изучить другие белки SARS-CoV-2, чтобы расширить терапевтический спектр COVID-19.

Об исследовании

В настоящем исследовании исследователи изучили белок-белковые взаимодействия SARS-CoV-2-хозяин свернутых PD, кодируемых геномом SARS-CoV-2, и SLiM в протеоме человека.

Конструкции экспрессии PD (n = 31) были созданы из белков SARS-CoV-2 (n = 22), из которых 26 PD были использованы для скринингового скрининга селекции фагового дисплея ProP-PD против библиотеки пептидов человеческого расстройства (HD2). В библиотеке HD2 обнаружены перекрывающиеся аминокислоты (а.о.) пептиды (n = 16) в неупорядоченных участках протеома хозяина на поверхности фага М13.

Анализ NGS (секвенирование следующего поколения) выполняли для анализа сайтов, кодирующих пептиды обогащенного связыванием фагового пула, и анализ поляризации флуоресценции (FP) проводили для оценки аффинности связывания. Для оценки связывания пептид-неструктурный белок 3 (Nsp3) с убиквитин-подобным белком 1 (Ubl1) был проведен прогнозный анализ in silico .

Был проведен анализ обогащения терминов генной онтологии (GO) и изучены взаимодействия на основе SLiM. Анализ ProP-PD и массивы SPOT для сканирования аланином были выполнены для установления ключевых детерминант специфичности. Анализ ядерно-магнитного резонанса (ЯМР) проводили для изучения поверхностей связывания пептидов. Роль выявленных белок-белковых взаимодействий в репликации SARS-CoV-2 исследовали путем проведения экспериментов на клеточных культурах с использованием клеток VeroE6 с 11 пептидными лигандами.

Полученные результаты

Одиннадцать свернутых PD генома SARS-CoV-2 были связаны с пептидами генома человека. Было обнаружено, что из 281 высокого/среднего (восемь/273) пептида 239 белков-хозяев взаимодействуют с PD SARS-CoV-2 (n = 11), включая Nsp1,3,5,8,9 и 16, Ubl1, дифференцировку адипоцитов. -родственный белок (ADRP), SUD-M, открытая рамка считывания (Orf)-8, 9b и нуклеокапсидный (N) белок с N-концевым доменом (NTD).

Белками и PD, успешно экспрессируемыми в исследовании, были Nsp1,4, 5, 7, 8, 9, 10,13, 15, 16, Ubl1,2, ADRP, SUD-N, M, C, папаиноподобная протеаза (PLpro) и связывание NGFI-A (NAB), из которых Nsp1, 5, 8, 9, 16, Ubl1, ADRP и SUD-M обогащены лигандами в селекциях ProPPD. Большинство идентифицированных взаимодействий включали Nsp9 (n=118), Nsp1 (n=47) и основную протеазу Nsp5 (Mpro, n=32).

На основе пептидов селекции ProP-PD были установлены консенсусные мотивы для белков Nsp9 G[FL]xL[GDP] и Nsp5 [FLM][HQ][AS]. Для Mpro Nsp5 белковые лиганды потенциально могут служить субстратами, поскольку мотив идентификации напоминает предпочтительный протеолитический сайт LQ↓[GAS] протеазы.

Анализ FP 23 пептид-пептидных взаимодействий с участием восьми PD SARS-CoV-2 показал аффинность связывания в микромолярном диапазоне. Остатки лейцина в P1 (положение 1) с остатками тирозина в P5 были необходимы для связывания, что указывает на то, что мотив связывания Nsp3 Ubl1 в NCOA21074-1089 был LxxxY. Наблюдалось обогащение лигандами, связанными с процессами регуляции транскрипции. Домены Nsp3 SUD-M, Ubl1 и ADRP продемонстрировали способность к взаимодействию с SLiM, и 18 идентифицированных белок-белковых взаимодействий соответствовали тем, о которых сообщалось в предыдущих исследованиях.  

Ключевые детерминанты специфичности были установлены для шести PD, два и четыре из которых были идентифицированы с помощью анализов ProP-PD и аланинового сканирования соответственно. Следует отметить, что два пептида, нацеленные на Nsp9 и Nsp16, ингибировали репликацию SARS-CoV-2. Команда идентифицировала связывающие короткие пептиды, которые взаимодействовали с Nsp9 через мотив GΦxΦ[GDP], который также включает мотив GxxxG в С-концевой области Nsp9.

Этот мотив содержится в нескольких белках человека, поэтому взаимодействие с Nsp9 может повлиять на репликацию SARS-CoV-2. ЯМР-анализ показал, что связывание пептида нарушало гидрофобную упаковку ядра Nsp9 и, следовательно, мешало образованию димеров белка. Было обнаружено, что пептидные лиганды конкурируют с Nsp10 за связывание с Nsp16 и, следовательно, могут ингибировать взаимодействие Nsp10-Nsp16 и предотвращать репликацию SARS-CoV-2. В совокупности пептидные лиганды, нацеленные на ADRP, Nsp3, Nsp9 и Nsp16, ингибируют пролиферацию SARS-CoV-2 и, следовательно, могут быть потенциальными мишенями для разработки лекарств.

В целом результаты исследования показали, что скрининг ProP-PD является жизнеспособной стратегией для выявления человеческих пептидов, которые связываются с глобулярными доменами протеома SARS-CoV-2. Они также показали, что часть идентифицированных лигандов может ингибировать репликацию SARS-CoV-2 в клеточной культуре, и соответствующие пептиды могут быть разработаны в качестве проникающих в клетки препаратов против SARS-CoV-2. Результаты исследования расширяют репертуар пептидов, которые можно считать отправной точкой для открытия лекарств, нацеленных на SARS-CoV-2.

*Важное замечание

bioRxiv публикует предварительные научные отчеты, которые не рецензируются экспертами и, следовательно, не должны рассматриваться как окончательные, направляющие клиническую практику/поведение, связанное со здоровьем, или рассматриваться как установленная информация.