Группа под руководством исследователей из Массачусетской больницы общего профиля (MGH) преодолела серьезное препятствие для разрезания и редактирования ДНК с помощью ферментов CRISPR-Cas и других технологий. Недавняя инновация, опубликованная в журнале Nature Biotechnology , упростит и ускорит подходы к молекулярному клонированию и расширит их полезность.

Редактирование CRISPR-Cas изменило способность исследователей изменять ДНК, например, расщеплять определенные последовательности ДНК способами, невозможными с помощью рестрикционных ферментов, или белков, выделенных из бактерий, которые десятилетиями использовались для расщепления последовательностей ДНК в определенных местах. Хотя инструменты CRISPR-Cas можно запрограммировать для нацеливания и разрезания практически любой последовательности ДНК, основным ограничением в их нацеливании является требование сначала распознать короткую последовательность, фланкирующую мишень, называемую мотивом, прилегающим к протоспейсеру (PAM). Следовательно, ранее ДНК можно было разрезать только по участкам, фланкирующим этот специфический мотив.

В этом последнем исследовании команда, которая ранее разработала вариант CRISPR-Cas9, почти не содержащий PAM, названный SpRY, проверила его полезность в качестве универсального инструмента для расщепления ДНК.

Создав в лабораторных экспериментах комплексы SpRY и направляющей РНК (гРНК), нацеленные на более чем 130 последовательностей ДНК, ученые неожиданно обнаружили, что SpRY не содержит PAM in vitro и может эффективно расщеплять ДНК в любой последовательности, запрограммированной гРНК. Исследователи также показали, что их технология может преодолеть ограничения ферментов рестрикции.

Мы демонстрируем, что ДНК SpRY расщепляет или позволяет разрезать ДНК практически в любой последовательности, включая широкий диапазон, который ранее был недоступен для рестрикционных ферментов или других белков CRISPR-Cas. Этот новый метод позволяет исследователям резать ДНК в пробирке в любом месте ДНК по выбору. Новые возможности, предлагаемые SpRYgests, ускорят и снизят стоимость различных базовых исследовательских приложений, в том числе исследований, которые могут иметь в конечном итоге клинические последствия».

Бенджамин Кляйнстивер, доктор философии, старший автор, помощник исследователя в Центре геномной медицины Массачусетской больницы общего профиля и доцент Гарвардской медицинской школы

Исследователи предполагают, что SpRYgests может широко применяться для упрощения типичных подходов к молекулярному клонированию, для более сложных методов клонирования, для сборки библиотек секвенирования нового поколения и многих других целей.

Это исследование было проведено под руководством научного сотрудника доктора Кэтлин А. Кристи, которая поклялась никогда больше не использовать рестриктазы. Среди дополнительных соавторов Джимми А. Го, Рэйчел А. Сильверштейн, Роман М. Долл, Мегуму Мабучи, Ханна Э. Штуцман, Джиконг Линь, Линьюань Ма, Рассел Т. Уолтон, Лука Пинелло и Дж. Бретт Робб.

Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения и Национальным научным фондом.