В исследовании, размещенном на сервере препринтов bioRxiv *, была проверена гипотеза о том, что рецептор ангиотензинпревращающего фермента 2 (ACE-2) коронавируса тяжелого острого респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2) является не только фактором прикрепления при вирусной инфекции, но и играет роль в активации белка вирусного спайка для облегчения слияния мембран.

Фон

Вирус SARS-CoV-2 заражает клетки человека с помощью рецептора хозяина ACE-2. Белок вирусного спайка регулирует проникновение SARS-CoV-2 и инфекцию, поскольку он связывается с рецепторами ACE-2 на поверхности клетки человека. ACE-2 активируется посредством протеолитического расщепления и способствует слиянию между клеточной мембраной и вирусной оболочкой.

Косвенные данные исследований свидетельствуют о том, что ACE-2 может не только служить фактором прикрепления, но также может способствовать активации спайкового белка SARS-CoV-2 для слияния мембран. Лучшее понимание роли ACE-2 в слиянии мембран может помочь проиллюстрировать механизм заражения SARS-CoV-2 и предсказать будущую эволюцию SARS-CoV-2 и других подобных вирусов.

Изучение

В настоящем исследовании исследователи использовали связи дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) с липидами, поскольку они могут необратимо внедряться в мембраны и обеспечивать программируемую самосборку.

Используя этот подход, комплементарные нити ДНК, конъюгированные с липидами, могут быть вставлены в вирусные частицы, чтобы синтетические липосомы могли нацеливаться на частицы без необходимости использования физиологических рецепторов. Триггеры, необходимые для слияния, затем химически восстанавливаются и тестируются. Слияние выявляют с помощью оптической микроскопии отдельных вирусов, где изменение состояния вируса во время слияния отслеживают с помощью флуоресцентных красителей. Исследователи ранее использовали подход связывания ДНК и липидов для характеристики проникновения вирусов различными семействами вирусов, включая флавивирусы и ортомиксовирусы.

Исследователи измерили шипозависимое связывание и слияние с синтетическими, а также с клеточными мембранами с помощью синтетических липосом, чтобы убедиться в отсутствии рецептора ACE-2. Три шипа SARS-CoV-2 — D614G/N501Y, Wuhan и Omicron (B.1.1.529) — и два типа вирусных частиц — вирусоподобные частицы (VLP), полученные путем экспрессии белков S, M, E и N и в экспериментах использовались псевдовирусы на ядре ВИЧ.

Команда отдельно инкубировала мембраны-мишени и вирусные частицы с комплементарными цепями ДНК, конъюгированными с липидами DPPE. Они иммобилизовали мембраны-мишени в микрофлюидной проточной ячейке, позволяя вирусным частицам связываться.

Полученные результаты

Thorne Research, витамины D и K2, 25 мкг (1000 МЕ), 30 мл (1 жидк. унция)

Было обнаружено, что события слияния происходят только тогда, когда вирусные частицы прикрепляются к мембранам-мишеням и когда присутствует протеаза. Слияние в основном контролировали с помощью смешивания липидов между мембраной-мишенью и вирусной частицей и обнаруживали с помощью дегашения техасского красного красителя в вирусной оболочке, что приводило к усилению флуоресценции. ДНК-опосредованное связывание вируса с ACE-2 было специфичным; количество адсорбированных частиц уменьшилось более чем в 25 раз при исключении ДНК. Точно так же не было событий слияния в отсутствие экзогенной протеазы.

При сравнении кинетики вирусного слияния шипов Omicron и Wuhan, псевдотипированных на ядрах ВИЧ, и VLP Wuhan D614G/N501Y, использованных в этом исследовании, команда обнаружила, что, хотя оба псевдовируса показали одинаковую скорость слияния, VLP дали немного, но значительно более высокую скорость слияния.

Наблюдаемая разница в скорости слияния может быть связана с различными факторами, включая вариации плотности шиповидных белков в VLP по сравнению с ядром ВИЧ, белки E и M в VLP, мутации D614G/N501Y и процент активных шипов на Поверхность ВЛП.

Когда протеаза, используемая для активации, варьировалась в экспериментах Omicron и Wuhan, скорость слияния не была чувствительна к концентрации протеазы в диапазоне от 200 до 1000 мкг/мл. В соответствии с предыдущими сообщениями, трансмембранная протеаза, серин 2 ( TMPRSS2 ), не была эффективной в активации шипов Omicron для слияния мембран. Однако в случае частиц D614G/N501Y добавление 40 мкг/мл TMPRSS2 приводило к кинетике слияния, отличной от 200 мкг/мл трипсина.

Эти наблюдения позволяют предположить, что протеолитическое расщепление может не быть стадией, ограничивающей скорость слияния с мембраной связанных с ДНК VLP, поскольку изменение концентрации протеазы должно влиять на образование фермент-субстратного комплекса, а изменения в идентичности протеазы должны изменять кинетику слияния.

При одновременном добавлении растворимого ACE-2 к протеазе в экспериментах с использованием шипов Wuhan и Omicron наблюдалось значительное увеличение скорости кинетики смешения липидов. Это показывает, что, хотя конформации белка шипа, необходимые для слияния мембран, доступны без ACE-2, рецептор ACE-2 способствует конформациям шипа, которые способствуют слиянию мембран.

Вывод

В целом исследователи заметили, что при активации с использованием соответствующей протеазы псевдовирусы SARS-CoV-2, а также VLP не требуют ACE-2 для слияния мембран. Однако добавление растворимого ACE-2 ускорило реакцию слияния в уханьском штамме SARS-CoV-2 и варианте Omicron. Результаты кинетического анализа выявили как минимум две стадии, ограничивающие скорость слияния вирусных мембран. Один из шагов зависел от ACE-2, а другой — нет.

Приведенные выше данные подтверждают, что рецептор ACE-2 не является биохимически необходимым для слияния мембран SARS-CoV-2, если присутствует альтернативный фактор прикрепления. Поскольку ACE-2 действует как высокоаффинный фактор для прикрепления вируса к клеткам человека, замена его другими факторами прикрепления, тем не менее, может повлиять на способность SARS-CoV-2 развиваться и на среду приспособленности вируса для появления коронавирусов в будущем. .

*Важное замечание

bioRxiv публикует предварительные научные отчеты, которые не рецензируются экспертами и, следовательно, не должны рассматриваться как окончательные, направляющие клиническую практику/поведение, связанное со здоровьем, или рассматриваться как установленная информация.