В недавнем исследовании, размещенном на сервере препринтов medRxiv *, исследователи проанализировали последовательности праймеров и зондов рекомендованного Центрами по контролю и профилактике заболеваний США (CDC) универсального анализа полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени на вирус оспы обезьян (MPXV) ( с).

Фон

MPXV, вид рода ортопоксвирусов, имеет геном двухцепочечной дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК). Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) объявила повторное появление MPXV чрезвычайной ситуацией в области общественного здравоохранения 23 июля 2022 года после сообщений о более чем 66 000 случаев заболевания в 106 странах. MPXV является вторым таким вирусом, который быстро распространяется по всему миру после того, как коронавирус тяжелого острого респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2) постепенно стал эндемичным вирусом.

Что касается SARS-CoV-2, CDC выпустил тест ПЦР в реальном времени для обнаружения MPXV в образцах сточных вод, в котором использовались общие праймеры и зонды, нацеленные на штамм MPXV в Западной Африке и бассейне Конго. Точно так же другие анализы ПЦР в реальном времени обнаруживают MPXV в клинических образцах.

Проблема заключается в том, что праймеры и зонды, используемые в этих общих ПЦР-анализах, основаны на штаммах MPXV, циркулировавших почти десять лет назад в период с 2002 по 2009 год. должны были претерпеть существенные мутации.

Об исследовании

В настоящем исследовании исследователи извлекли 683 полных генома MPXV из базы данных глобальной инициативы по данным о птичьем гриппе (GISAID), доступной до 5 августа 2022 года, и сопоставили их олиго-последовательности с последовательностями праймеров используемых в настоящее время диагностических анализов MPXV. Кроме того, они сопоставили последовательности праймеров и зондов, а также их обратные комплементы в семи ПЦР в реальном времени против 1779 геномов MPXV и подсчитали процент геномов со 100% совпадением. Эти анализы нацелены на гены O2L, F3L, C3L и G2R для обнаружения MPXV.

Optimum Nutrition, Opti-Men, 150 таблеток

Команда также оценила три ПЦР-анализа в реальном времени, обнаруживающие вирусы рода Orthopoxvirus. Наконец, исследователи синтезировали праймеры с поправкой на несоответствие или фрагмент синтетического гена MPXV для проверки эффектов несоответствия и сравнили их с общим анализом для обнаружения MPXV.

Результаты исследования

Они использовали 1730 полных геномов MPXV, полученных во время всемирной вспышки 2022 года. Выравнивание последовательностей трех олигонуклеотидов и их обратных комплементов из общих анализов MPXV привело к получению общих прямых последовательностей MPXV (MPXV-F) со 100% идентичностью с четырьмя геномами и общего обратного праймера (MPXV-R), совпадающего с 1,73% геномов. Кроме того, исследователи обнаружили 31 несовпадение последовательностей в 99,08% и 97,46% общих прямых последовательностей MPXV (MPXV-F) и 32 общих обратных праймеров (MPXV-R) соответственно.

В то время как у первого была единственная синонимичная мутация A194165G в 99,08% опубликованных геномов MPXV, у второго была несинонимичная замена G194233A в 97,46% геномов. Напротив, последовательность зонда MPXV (MPV-P) была консервативной и соответствовала 99,31% геномов в базе данных.

Основной вывод исследования заключался в том, что используемые в настоящее время универсальные анализы MPXV могут не обеспечивать оптимальное и точное обнаружение MPXV. Независимо от его положения, каждое несовпадение в последовательности праймеров может снизить термостабильность дуплекса ДНК праймер-матрица и повлиять на эффективность ПЦР. Авторы отметили несоответствие двух праймеров и шаблонов, что в совокупности повлияло на эффективность ПЦР. Это дало примерно в 11 раз худшую оценку исходной матричной ДНК и четырехкратное увеличение 95% предела обнаружения (LOD). Следовательно, анализ с коррекцией несоответствия с абсолютной комплементарностью между праймерами и текущими геномами MPXV может обеспечить более чувствительное и точное обнаружение MPXV.

Кроме того, результаты исследования показали, что генетические вариации в областях праймер-зонд геномов MPXV могут указывать на временной и пространственный характер возникновения болезни обезьяньей оспы. Три анализа, MPV_F3L, MPV_G2R_WA, 283 и OPV_F8L, продемонстрировали наивысший показатель совпадения >99% с глобальной базой данных генома MPXV в 2022 г. Однако выбор анализа также зависит от типа образца. Например, эти три анализа хорошо работали для клинических образцов, но не для образцов сточных вод, которые могут содержать человеческие экскременты, а также экскременты кошек, собак, мышей, кроликов и коров.

Вывод

Анализ с коррекцией несоответствия, разработанный в исследовании, имел более 97% комплементарности геномам MPXV. Таким образом, он показал более высокую чувствительность и улучшенный потенциал количественного определения и может помочь в обнаружении MPXV.

Улучшенные диагностические возможности MPXV имеют решающее значение, поскольку сотрудники общественного здравоохранения и клиницисты борются со вспышкой MPXV. Таким образом, будущие исследования должны быть сосредоточены на разработке еще более совершенного диагностического анализа MPXV, который учитывает другие факторы, влияющие на диагностическую эффективность и эффекты, вызванные несоответствием (например, качество матричной ДНК, мастер-микс для ПЦР и образование димеров праймеров).

*Важное замечание

medRxiv публикует предварительные научные отчеты, которые не рецензируются экспертами и, следовательно, не должны рассматриваться как окончательные, направляющие клиническую практику/поведение, связанное со здоровьем, или рассматриваться как установленная информация.