В недавнем исследовании, опубликованном на сервере препринтов medRxiv *, исследователи разработали биосенсор на основе модифицированного антителами (Ab) графенового полевого транзистора (GFET) для сверхточного и быстрого обнаружения вируса гриппа A (IAV) и коронавируса тяжелого острого респираторного синдрома 2 (SARS). -CoV-2) обнаружение и дифференциация белка.

Фон

Пандемия коронавирусной болезни 2019 года (COVID-19) подчеркнула необходимость в новых диагностических устройствах для оказания медицинской помощи, которые могут быстро обнаруживать и дифференцировать вирусы, которые, хотя и вызывают инфекции с идентичными физиологическими симптомами, требуют специфической и целенаправленной терапии. Инфекции SARS-CoV-2 могут усугубить инфекцию IAV, увеличивая глобальную нагрузку на здравоохранение.

Анализ полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) в настоящее время является золотым стандартом для обнаружения вирусов. Однако Центры США по контролю и профилактике заболеваний (CDC) сообщили, что ОТ-ПЦР не подходит для выявления ранних респираторных вирусных инфекций, с длительным анализом и необходимостью транспортировки образцов в хорошо оборудованные лаборатории.

Об исследовании

В настоящем исследовании исследователи разработали датчик GFET, модифицированный антителами, для одновременного обнаружения IAV и SARS-CoV-2 и IAV сверхточным и быстрым способом.

Чип сенсора состоял из четырех GFET в четырехкратном расположении, разделенных корпусами из полидиметилсилоксана (PDMS). Каждый квартал был биохимически функционализирован антителами, нацеленными на антигены SARS-CoV-2 и IAV , один химически пассивированный контроль и один голый контроль.

 Третий (химически пассивированный) GFET был развернут, чтобы гарантировать, что наблюдаемые результаты были связаны с взаимодействием Ab-антиген, а не с электронными флуктуациями или дрейфами.

Внутренний корпус PDMS был короче внешнего, чтобы обеспечить независимую биохимическую функционализацию для каждого GFET, позволяя GFET действовать через общие ворота и среду. Электрод в виде гранул Ag/AgCl (серебро/хлорид серебра) погружали в общую среду, чтобы он функционировал как электрод затвора.

PBASE (сукцинимидиловый эфир 1-пиренбутановой кислоты) инкубировали на поверхности графена для целенаправленной иммобилизации, а PEG-NH2 использовали в качестве блокирующего реагента для обеспечения специфичности реакции. Иммобилизацию PBASE на графене оценивали с помощью электрических характеристик и рамановской спектроскопии.

 Для обнаружения SARS-CoV-2 и IAV использовали антитело CR3022, нацеленное на рецептор-связывающий домен белка шипа (S) SARS-CoV-2 (RBD), и сконструированное FI6v3 Ab, связывающееся с белком гемагглютинина (HA) IAV.

Взаимодействия антиген-Ab зависели от равномерной диффузии вируса в низкоконцентрированном (0,01X) фосфатно-буферном растворе электролита с EDL (двойным электрическим слоем) от 4 до 15 нм, генерируемым на участке графен-электролит, служащем двойным электрическим слоем. . От пользователя требовалось добавить только одну каплю раствора поверхностного белка вируса на сенсорное устройство. Платформа биосенсора была протестирована против нескольких концентраций вирусных белков, а взаимодействие вирусного белка (антигена) и антител было подтверждено с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA).

Тестовый анализ был выполнен с использованием BSA (альбумина бычьей сыворотки) в качестве контрольного аналита для оценки специфичности устройства. Чтобы оценить чувствительность устройства, были выполнены временные измерения, при которых все транзисторы GFET подвергались воздействию различных концентраций белков SARS-CoV-2 S и IAV HA в разные интервалы времени. Диапазон напряжения от 120 мВ до 200 мВ показал наибольшую крутизну и, таким образом, был выбран для датчика, чтобы обеспечить максимальную чувствительность.

Полученные результаты

Конструкция биосенсора позволила функционализировать изолированный и целенаправленный биохимический графеновый канал с помощью общей среды для введения аналита и последующего преобразования в изменение проводимости Ab-модифицированного GFET.

Команда наблюдала постграфеновую функционализацию пика 1623 см -1 с помощью PBASE в спектроскопии комбинационного рассеяния, одновременно с пиреновым резонансом и дырочным легированием (сдвиг пика вправо) и сдвигом вправо CNP (точка нейтрального заряда) и I 2D / I G снижение . от 2,9 до 1,2 при анализе электрических характеристик. Результаты показали присоединение PBASE к поверхности графена. Сложный эфир NHS (N-гидроксисукцинимид) в PBASE реагировал с первичными аминами вирусных белков, обеспечивая иммобилизацию Ат.

Тестируемые антитела были нацелены на вирусный антиген с незначительной перекрестной реактивностью. Время обработки биосенсора GFET составляло всего 10 секунд, что позволяло проводить быструю и точную диагностику. Производительность биосенсора может позволить диагностировать ранние вирусные инфекции. CR3022 может связываться с вариантами SARS-CoV-2, такими как Delta и Omicron, а FI6v3 может связываться со всеми подтипами IAV 1 и 2 типа, что свидетельствует о широкой диагностической широте биосенсора.

Использование низкоконцентрированных фосфатных буферов, напряжения и ПЭГ-NH2 при функционализации позволило получить очень высокую чувствительность сенсора с превосходным разрешением для обнаружения аналитов при очень низких концентрациях белка. Самые низкие эффективные концентрации белков (предел обнаружения, LoD) белков SARS-CoV-2 и IAV составили 88 мкМ и 227 мкМ соответственно, что в пять раз ниже, чем ранее использовавшиеся платформы.

В целом, результаты исследования подчеркивают использование биосенсора на основе GEFT, модифицированного антителами, для быстрого, сверхточного, чувствительного, специфичного и экономичного обнаружения различных вариантов SARS-CoV-2 и подтипов IAV. Универсальный биосенсор LoD превзошел минимальные потребности LoD в 163 fM и 16 aM для образцов носа и слюны, соответственно, потенциально уменьшая время, необходимое для введения теста после воздействия вируса.

*Важное замечание

medRxiv публикует предварительные научные отчеты, которые не рецензируются экспертами и, следовательно, не должны рассматриваться как окончательные, направляющие клиническую практику/поведение, связанное со здоровьем, или рассматриваться как установленная информация.