В недавнем исследовании, опубликованном на сервере препринтов bioRxiv * , исследователи использовали различные методы аналитической характеристики для определения биофизических свойств самоамплифицирующейся вирусной рибонуклеиновой кислоты (РНК) вакцины (IMP-1) Имперского колледжа Лондона (IMP-1), разработанной для тяжелого острого респираторного синдрома коронавируса. 2 (ТОРС-КоВ-2).

Фон

С момента начала пандемии коронавирусной болезни 2019 (COVID-19) в конце 2019 года технологии вакцин, особенно разработка матричной РНК-вакцины , значительно продвинулись вперед в попытке смягчить тяжесть и передачу инфекции SARS-CoV-2.

Самоамплифицирующиеся (sa) РНК-вакцины представляют собой улучшение по сравнению с мРНК-вакцинами, поскольку самоамплифицирующийся репликон позволяет аппарату клетки-хозяина создавать множественные копии РНК-мишеневого антигена. Хотя это дает преимущество введения в 10-100 раз меньших доз вакцины, самоусиливающийся код делает вакцину более объемной, чем обычные мРНК-вакцины.

Преимущества РНК-вакцин заключаются в простоте их разработки, производства или модификации. Процесс производства мРНК-вакцины включает в себя различные этапы, начиная с транскрипции молекулы РНК in vitro и заканчивая очисткой и инкапсуляцией в липидную наночастицу. На каждом этапе процесса используются различные реагенты и несколько подпроцессов, и малейшая ошибка в любом из них может привести к неэффективной или неполной вакцине.

Таким образом, аналитическая характеристика и контроль качества необходимы для производства эффективных мРНК-вакцин.

Об исследовании

В настоящем исследовании исследователи использовали ультрафиолетовую (УФ) спектроскопию, биологическое малоугловое рассеяние (BioSAXS), динамическое рассеяние света (DLS) и круговой дихроизм (CD) для характеристики биофизических свойств IMP-1. Эта saRNA-вакцина содержит генетический код предварительно слитого стабилизированного шиповидного белка SARS-CoV-2 и репликазы вируса венесуэльского конского энцефалита (VEEV).

мРНК IMP-1 транскрибировали in vitro, очищали и концентрировали с использованием тангенциальной проточной фильтрации и хроматографии. Чистоту и концентрацию мРНК IMP-1 оценивали с помощью анализа УФ-спектрометрии A 260/280 . Соотношение между значениями поглощения при 260 нм и 280 нм используется для определения чистоты РНК, а отношения ниже двух указывают на загрязнение белками.

Затем исследователи выполнили DLS, метод рассеяния света на основе раствора, чтобы определить полидисперсность и размер молекул РНК в цитратно-натриевом или фосфатно-натриевом буфере. РНК IMP-1 в цитрате натрия также использовали в экспериментах BioSAXS для определения размера и формы РНК. BioSAXS — это высокопроизводительный процесс, требующий очень небольшого количества очищенных образцов, и его можно проводить с использованием автономных домашних рентгеновских или синхротронных установок.

Наконец, CD был выполнен на РНК в натрий-фосфатном буфере и воде, чтобы понять структуру и хиральность или конформацию молекулы РНК. Спектры КД измеряли с использованием спектрофотометра в диапазоне длин волн от 320 до 180 нм.

Полученные результаты

Результаты показали, что молекула РНК IMP-1 содержит 11 551 пару оснований и весит 3,71 МДа. Соотношение УФ-спектроскопии А 260/280 составило 2,18, что указывает на то, что РНК не содержала белковых примесей.

Эксперименты DLS и BioSAXS определили диаметр молекулы РНК как 873,63 Å. Метод DLS был выполнен на двух разных буферах, и Z-средний диаметр и индекс полидисперсности (PDI) для РНК немного, но значительно различались для обоих буферов, что указывает на то, что тип буфера, ионная сила и pH влияют на размер РНК.

Спектры КД, которые выявляют структурные и конформационные особенности молекулы РНК, указывают на правостороннюю А-форму спирали РНК и стэкинг-взаимодействия в молекуле РНК IMP-1. Спектры измерений с использованием воды показали меньший спиральный сигнал, что указывает на то, что, как и в случае DLS, результаты CD зависят от буфера. В качестве аналитического метода CD очень полезен для наблюдения за влиянием буфера, pH, температуры, денатурантов и солей на структуру и конформацию РНК.

Авторы также обсудили проблемы доставки отрицательно заряженных молекул мРНК и использования инкапсуляции липидных наночастиц для стабилизации и эффективной доставки вакцины.

Выводы

Подводя итог, в исследовании изучались различные методы аналитической характеристики для изучения чистоты, размера, полидисперсности, структуры и конформации молекулы мРНК IMP-1, транскрибированной с плазмиды, несущей генетический код шиповидного белка SARS-CoV-2 и репликазы VEEV. .

Методы УФ-спектрометрии, DLS, BioSAXS и CD, изученные в исследовании, предоставили ценную информацию о концентрации, размере, форме и структуре молекулы РНК. Исследование также выявило влияние буфера, рН и ионной силы на структуру РНК. Авторы считают, что дополнительные методы, такие как дифференциальная сканирующая калориметрия и малоугловое рассеяние нейтронов, могут лучше понять термодинамику, стабильность и структуру молекулы РНК при соответствующих физиологических температурах.

*Важное замечание

bioRxiv публикует предварительные научные отчеты, которые не рецензируются экспертами и, следовательно, не должны рассматриваться как окончательные, направляющие клиническую практику/поведение, связанное со здоровьем, или рассматриваться как установленная информация.