В недавнем исследовании, размещенном на сервере препринтов bioRxiv *, исследователи разработали трехмерную (3D) модель ткани in vitro для оценки воздействия коронавируса тяжелого острого респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2) на эндотелиальные клетки сосудов.
Модели in vitro необходимы для лучшего понимания патогенности коронавирусной болезни 2019 (COVID-19). Ранее in vitro были разработаны двумерные (2D) модели тканей для изучения воздействия инфекции SARS-CoV-2 на эндотелий со сниженной экспрессией молекул клеточной адгезии, нарушением эндотелиального барьера и повышенной секрецией воспалительных цитокинов в эндотелиальных клетках. Однако из-за невозможности моделирования сосудистых сетей 2D-модели не могут моделировать условия in vivo так же точно, как 3D-модели.
Авторы настоящего исследования ранее использовали индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки (hiPSC), которые были дифференцированы в эндотелиальные предшественники (EP) и инкапсулированы в структуры коллагенового гидрогеля для оценки ангиогенеза.
Об исследовании
В настоящем исследовании исследователи расширили свой предыдущий анализ, создав 3D-модель для изучения нарушения сосудистой сети при COVID-19.
Для анализа hiPSC, полученные из дермальных фибробластов крайней плоти человека (DF19-19-9-11T), культивировали и дифференцировали в hiPSC-EP. Затем кластер дифференцировки (CD)34 + hiPSC- EP выделяли с помощью анализа FACS (сортировка клеток, активируемая флуоресценцией), и клетки CD34 + hiPSC- EP инкапсулировали в структуру коллагенового гидрогеля.
Инкапсулированные гидрогели культивировали в течение недели для образования капиллярных сетей. После пяти дней инкапсуляции гидрогели коллагена, нагруженные CD34 + -hiPSC-EP, обрабатывали шиповидным белком (S) SARS-CoV-2 (CSP) для имитации инфекций SARS-CoV-2. Анализы высвобождения цитокинов проводили для измерения экспрессии воспалительных цитокинов после лечения CSP. Сосудоподобные сети, образующиеся в коллагеновых гидрогелях, нагруженных CD34 + iPSC — EP, визуализировали с помощью иммуноцитохимии.
Клетки также обрабатывали дексаметазоном и визуализировали с помощью конфокальной микроскопии. Длина сосуда, связность сосудов и диаметр просвета сосуда были проанализированы на основе ранее разработанного вычислительного конвейера. Рибонуклеиновая кислота (мРНК) мессенджера SARS-CoV-2 из гидрогелей была подвергнута анализу qRT-PCR (количественная обратная транскрипция-полимеразная цепная реакция) для количественного определения экспрессии мРНК на основе значений порога цикла (Ct).
Кроме того, команда исследовала, экспрессируют ли CD34 + -hiPSC, образующие сосудистые сети в коллагеновых гидрогелях, ангиотензинпревращающий фермент 2 (ACE2). Кроме того, оценивали экспрессию нескольких эндотелиальных генов, таких как KDR (рецептор домена вставки киназы), CD31, CDH5 (кадгерин 5) и CD34, для отслеживания созревания эндотелия в течение недельного периода культивирования и корреляции уровней с экспрессией ACE2.
Полученные результаты
Лечение CSP значительно снижало долю формирующих сосуды клеток и связность сосудистой сети в hiPSCs-производных EP, инкапсулированных в коллагеновые гидрогели. В соответствии с клиническими данными наблюдалась повышенная экспрессия воспалительных цитокинов, а лечение дексаметазоном в дозе 17 нг/мл уменьшало сосудистую дисфункцию в клетках, обработанных CSP. Даже в отсутствие иммунологических клеток команда может использовать трехмерную модель ангиогенеза in vitro для имитации дисфункции эндотелиальных клеток, вызванной инфекцией SARS-CoV-2, характерной для клинических проявлений COVID-19.
После лечения CSP сосудистая сеть показала снижение плотности и большее количество клеток с измененной округлой морфологией. Обработка CSP (10 мкг/мл) приводила к уменьшению количества конечных точек сосудов, точек разветвлений и соединений сосудов на 22%, 33% и 29% соответственно. Соответствующее снижение, наблюдаемое при использовании CSP в концентрации 100 мкг/мл, составило 17%, 24% и 22% соответственно.
Потеря соединения сосудистой сети наблюдалась среди коллагеновых гидрогелей, обработанных CSP, с уменьшением на 77% доли клеток, которые были частью самой большой сосудистой сети. При добавлении CSP в первый день наблюдалось снижение на 19% и 31% точек ветвления сосудов и объемных долей коллагеновых гидрогелей, содержащих клетки, формирующие сосуды, соответственно. Соответствующее снижение, наблюдаемое при добавлении CSP на пятый день, составило 59% и 66% соответственно, что указывает на более высокую токсичность CSP при добавлении на пятый день после начала формирования сосудистых сетей.
Экспрессия ACE2 была самой высокой в день 0 и снизилась на 62% в течение недели после лечения CSP. Команда наблюдала 2,7-кратное и 6,7-кратное снижение экспрессии CD34 в первый и пятый дни соответственно. Напротив, экспрессия CD31 увеличилась в два, четыре и семь раз на 1-й, 5-й и 7-й день соответственно, а экспрессия CDH5 увеличилась в два и три раза на пятый и седьмой день соответственно.
Обработка CSP значительно увеличивала высвобождение интерлейкина-8 (IL-8) и лиганда 1 мотива хемокина CXC (CXCL1) в два и три раза соответственно. Оба цитокина продуцируются эндотелиальными клетками и активируются при COVID-19. Полученные данные показали, что лечение CSP вызывало воспалительное состояние, сравнимое с цитокиновым штормом , зарегистрированным в тяжелых случаях COVID-19.
В целом, результаты исследования показали успешное воспроизведение вызванной COVID-19 эндотелиальной дисфункции, наблюдаемой в клинических условиях, с использованием коллагеновых гидрогелей, нагруженных hiPSC-EP, обработанных CSP. Лечение CSP вызывало значительное нарушение работы сосудов, касающееся клеток сосудистой сети и связности сосудистой сети, которое ингибировалось дексаметазоном.
*Важное замечание
medRxiv публикует предварительные научные отчеты, которые не рецензируются экспертами и, следовательно, не должны рассматриваться как окончательные, направляющие клиническую практику/поведение, связанное со здоровьем, или рассматриваться как установленная информация.
Leave a Comment
Your email address will not be published. Required fields are marked with *