В недавнем исследовании, опубликованном в iScience , исследователи разработали бипаратопические нанотела против тяжелого острого респираторного синдрома коронавируса 2 (SARS-CoV-2).

Фон

Несмотря на быструю разработку эффективных и безопасных вакцин против SARS-CoV-2, преобладают вопросы, касающиеся их долгосрочной эффективности , что требует продолжения поиска новых терапевтических стратегий. Рекомбинантные белковые биологические препараты, такие как моноклональные антитела (мАт), обладают потенциалом для профилактики и лечения инфицированных людей.

Кроме того, нанотела, антитела, содержащие один вариабельный домен, являются нативными для семейства верблюдовых. Небольшой размер, высокая стабильность и простая архитектура нанотел имеют преимущества перед обычными mAb. Они обеспечивают улучшенное проникновение в ткани со склонностью к высокоаффинному связыванию с небольшими эпитопами. Кроме того, нанотела поддаются ковалентным связям для улучшения функций и обычно имеют более высокий выход и более низкие производственные затраты.

Исследование и выводы

В настоящем исследовании ученые выделили нанотела против рецептор-связывающего домена шипа SARS-CoV-2 (RBD) с использованием библиотеки синтетических дрожжей. RBD были сконструированы в двух форматах: 1) мономер RBD с AVI-меткой для биотинилирования и 2) димерный RBD-Fc, в котором RBD был слит с фрагментом кристаллизуемого (Fc) домена мышиного IgG1.

Зонды RBD были проверены путем временной трансфекции клеток 293T человеческим ангиотензинпревращающим ферментом 2 (hACE2) и окрашивания тетрамеризованными мономерами RBD. Авторы отметили ACE2-зависимое связывание зондов RBD с клетками 293T, подтверждая их функциональную целостность. Эти тетрамеры использовали для создания RBD-специфических нейтрализующих нанотел из библиотеки дрожжевого дисплея.

Селекция включала два последовательных этапа магнитного обогащения, за которым следовало обогащение на основе сортировки флуоресцентно-активированных клеток (FACS), в результате чего была получена библиотека, содержащая примерно 72% RBD-связывающих клонов дрожжей. Затем библиотека была окрашена тетрамерами RBD из SARS-CoV-1 и SARS-CoV-2, что выявило различные популяции.

Одна популяция (основная) связывала исключительно тетрамеры RBD SARS-CoV-2, тогда как другая (незначительная) популяция связывала тетрамеры RBD обоих вирусов. Вероятно, перекрестно-реактивные клоны SARS-CoV-1/2 могут иметь консервативный эпитоп RBD, представляющий собой важную мишень. Затем клоны сортировали по отдельным клеткам и секвенировали 10 лучших клонов с наиболее ярким окрашиванием тетрамера RBD.

Векторы экспрессии млекопитающих клонировали с ДНК RBD-специфических нанотел, и нанотела очищали. Авторы проверили, ингибируют ли очищенные нанотела взаимодействие ACE2-RBD, используя тест нейтрализации суррогатного вируса (sVNT), и обнаружили четыре клона нанотел (A11, B1, C8 и G8), которые ингибировали связывание. Следует отметить, что только нанотело G8 было перекрестно-реактивным против SARS-CoV-1/2.

Способность клонов нанотел к связыванию RBD оценивали с помощью поверхностного плазмонного резонанса (SPR). Четыре нанотела связывали RBD SARS-CoV-2 с умеренной аффинностью, в то время как только G8 связывал RBD SARS-CoV-1, хотя и с пониженной аффинностью. Дальнейшие эксперименты на основе SPR выявили два различных способа связывания: один включал связывание с общим эпитопом (для конструкций A11, B1 и C8), а другой — с другим эпитопом (G8), который был более консервативен в пределах SARS-CoV-1. РБД.

Хотя нанотела проявляли умеренное сродство, маловероятно, что они могли сильно нейтрализовать инфекцию по сравнению с несколькими используемыми моноклональными антителами с высоким сродством. Поэтому исследователи создали серию конструкций нанотел, чтобы увеличить нейтрализующую способность мономеров нанотел. Использовали клоны нанотел с наивысшей аффинностью (G8 и B1). Эти эксперименты по улучшению включали три разные стратегии.

Сначала Fc-домен IgG1 человека сливали с нанотелами (конструкции B1-Fc и G8-Fc). Во-вторых, B1 и G8 были ковалентно соединены (бипаратопные конструкции) через глицин-сериновый (GS) линкер. Бипаратопные (BP) конструкции были созданы с тремя различными длинами линкера (10, 19 и 39 аминокислот). В-третьих, димерные бипаратопические конструкции были созданы с использованием доменов Fc IgG1 человека. Был проведен анализ микронейтрализации, чтобы проверить, ингибируют ли конструкции инфекцию SARS-CoV-2.

В качестве мономеров B1 и G8 умеренно ингибируют инфекцию; однако димеризация Fc любого нанотела улучшала их нейтрализующую активность. Примечательно, что мономерные бипаратопные конструкции заметно усиливали нейтрализацию, увеличиваясь с увеличением длины линкера. Fc-димеризация бипаратопных конструкций приводила к мощной нейтрализующей активности; однако они были менее эффективны, чем их мономерные аналоги.

Кроме того, бипаратопические нанотела были протестированы с использованием массива мультиплексных вариантов RBD для оценки их способности преодолевать побег вируса. Было измерено связывание нанотел с RBD из вызывающих озабоченность вариантов SARS-CoV-2 (VOC) и ингибирование RBD-ACE2. Конструкция G8-Fc связывалась со всеми протестированными вариантами с высокой активностью, но нанотело B1-Fc продемонстрировало пониженное связывание с бета- и гамма-вариантами RBD и теми, которые содержат замены E484D, E484K, Q493K и S494P.

Тем не менее, бипаратопное нанотело с линкером из 10 аминокислот (BP10) имело сходный профиль с G8-Fc. Ингибирование взаимодействия RBD-ACE2 было протестировано в sVNT на основе шариков с использованием 20 различных RBD, в том числе из SARS-CoV-1, коронавирусов летучих мышей и панголинов , а также вариантов Omicron BA.1 и BA.2.

Результаты были аналогичны результатам мультиплексного массива. Однако конструкции нанотел не нейтрализовали варианты Омикрона. Наконец, мышей отдельно обрабатывали конструкциями B1-Fc, G8-Fc и BP10-Fc и заражали SARS-CoV-2 через 24 часа. Лечение G8-Fc умеренно снижало вирусную нагрузку в легких. Напротив, мыши, обработанные B1-Fc или BP10-Fc, были полностью защищены.

Выводы

Таким образом, исследование продемонстрировало выделение нейтрализующих SARS-CoV-2 нанотел с использованием библиотеки дрожжевого дисплея и то, что создание бипаратопных нанотел может улучшить их нейтрализующую активность, по-видимому, за счет перекрестного связывания отдельных шиповидных белков . Интересно, что димеризация бипаратопных конструкций не привела к усилению нейтрализации по сравнению с их мономерными аналогами.