В недавнем исследовании, опубликованном в журнале Nature Chemical Biology , исследователи исследовали использование соединений нитрата аминоадамантана в качестве препаратов против тяжелого острого респираторного синдрома коронавируса 2 (SARS-CoV-2).

Фон

Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США одобрило мемантин, аминоадамантановый препарат, для лечения болезни Альцгеймера. Опираясь на свой опыт, исследователи изучили, могут ли они нацелить виропориновый канал белка оболочки (E) SARS-CoV-2 с помощью молекулярной боеголовки на рецептор ангиотензинпревращающего фермента 2 (ACE2). ACE2 связывается с шиповидным белком (S) SARS-CoV-2, который вызывает инфекцию, и ингибирование этой реакции может дать новый механизм действия лекарства для лечения коронавирусной болезни 2019 (COVID-19).

Нитраты аминоадамантана могут действовать как химические зонды с двойным механизмом. Хотя аминоадамантановая часть может блокировать виропориновый канал белка E SARS-CoV-2, она также может нацеливаться на доставку группы, связанной с оксидом азота (NO), к S-нитрозилату, чтобы ингибировать реакцию связывания S и ACE2.

Интересно, что отдельные сообщения предполагают, что аминоадамантановые препараты обладают некоторой эффективностью против SARS-CoV-2. Терапия на основе NO также продемонстрировала многообещающие результаты в клинических испытаниях на людях для лечения COVID-19. Однако окончательные данные, подтверждающие их, отсутствуют.

Об исследовании

В настоящем исследовании исследователи разработали соединения нитрата аминоадамантана с двойным механизмом для ингибирования проникновения SARS-CoV-2 в клетки-хозяева путем S-нитрозилирования ACE2. Кроме того, исследователи проверили, являются ли эти соединения нетоксичными, in vitro, используя клетки HELA, и in vivo, используя модель COVID-19 сирийского хомяка.

Они подвергли клетки HeLa, стабильно экспрессирующие человеческий ACE2 (HeLa-ACE2), воздействию SNOC и оценили образование SNO-ACE2 с помощью анализа переключения биотина. Другими словами, они изучили молекулярный механизм, посредством которого NO и родственные ему виды ингибируют активность SARS-CoV-2. Кроме того, они оценили связывание клеток S и HeLa-ACE2, для чего инкубировали клетки с очищенными рекомбинантными SARS-CoV-S1 и S2.

Команда протестировала эффективность мемантина/NMT1, амантадина/NMT4 и других соединений нитрата аминоадамантана, NMT2, NMT3 и NMT5-NMT9 замаскированным образом против живых SARS-CoV-2 в клетках HeLa-ACE2, чтобы определить их терапевтический потенциал на основе по индексу селективности (SI). В качестве положительного контроля использовали ремдесивир, апилимод и пуромицин. SI сравнивает полумаксимальную неспецифическую цитотоксичность соединения (CC50) в отсутствие инфекции с его полумаксимальной эффективной противовирусной концентрацией (EC50).

Для дальнейшего изучения влияния NMT5 на связывание S-ACE2 SARS-CoV-2 команда провела эксперименты по совместной иммунопреципитации (co-IP) этих двух белков в присутствии и в отсутствие NMT5 с использованием антитела против ACE2.

ACE2 человека содержит восемь остатков цистеина (Cys), из которых Cys261 и Cys498 присутствуют в виде свободных тиолов. Эти два, вероятно, доступны для S-нитрозилирования посредством обратимой нуклеофильной атаки на нитрозоазот с образованием аддукта SNO-белок. Таким образом, исследователи также выполнили сайт-направленный мутагенез этих остатков цистеина в ACE2, чтобы подтвердить результаты анализов переключения биотина. Кроме того, они выполнили масс-спектрометрию (МС) после воздействия SNOC для выявления участков S-нитрозилирования.

Результаты исследования

Результаты исследования показали, что ACE2, клеточный рецептор SARS-CoV-2 S, может подвергаться S-нитрозилированию донором NO и транснитрозилирующим агентом S-нитрозоцистеином (SNOC). Эта реакция нитрозилирования, по-видимому, ингибирует проникновение SARS-CoV-2, инфекционность и цитотоксичность. Сайт-направленный мутагенез подтвердил, что мутация C261A/C498A значительно ингибировала SNOC-опосредованное S-нитрозилирование в анализах переключения биотина, а MS подтвердила присутствие S-нитрозилированного ACE2 в Cys261 и Cys498.

Из семи соединений нитрата аминоадамантана, протестированных в исследовании, амантадин и мемантин не показали эффективности против живого SARS-CoV-2. NMT5 продемонстрировал самую высокую защиту от SARS-CoV-2 с EC50 5,28 мкМ и SI 9,2. Более того, эта концентрация NMT5 находилась в пределах микромолярных количеств, достижимых в тканях человека при хорошо переносимых дозах, что наблюдалось у двух видов животных.

Пять мкМ NMT5 уменьшали co-IP, указывая на то, что он может в значительной степени ингибировать связывание S-белка с ACE2 и что интактный остаток Cys необходим для связывания S-ACE2. Либо мутация Cys, либо S-нитрозилирование могут значительно уменьшить взаимодействие белка S с ACE2.

Выводы

Исследователи разработали новое соединение нитрата аминоадамантана, NMT5, в качестве химического зонда для ингибирования активности SARS-CoV-2 путем S-нитрозилирования белка. Его нитрогруппа нацелена на ACE2, блокируя виропориновый канал белка Е. Эти механистические идеи будут способствовать разработке препаратов нитрата аминоадамантана для острой противовирусной терапии COVID-19.

Поскольку NMT5 может предотвращать связывание S-белка SARS-CoV-2 с рецептором ACE2 путем целенаправленного S-нитрозилирования рецептора, он также должен быть способен ингибировать связывание новых вариантов S-белка с ACE2, поскольку сам ACE2 заблокирован.

Более того, нитраты аминоадамантана для лекарственной терапии COVID-19 могут дополнять другие лекарственные препараты, вакцины и антитела, которые зависят от антигенных участков S-белка. Кроме того, связывание NMT5 с E-виропориновым каналом может дать возможность блокировать распространение SARS-CoV-2 от одного хозяина к другому.