В недавнем исследовании, опубликованном в PNAS , исследователи изучили in vivo эффективность белков, кодируемых коронавирусом тяжелого острого респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2), против нервно-мышечной (НМ) дегенерации, связанной с остановкой рибосом.

Фон

Связанная с возрастом нейродегенерация представляет собой кризис общественного здравоохранения, который требует разработки целенаправленных, эффективных и широких терапевтических средств, влияющих на заболевание; однако данные о том, в какой степени патофизиологические механизмы являются общими для различных нейродегенеративных заболеваний, ограничены. Контроль механизма трансляции необходим для поддержания протеостаза при старении и для борьбы с вирусными инфекциями.

Об исследовании

В настоящем исследовании исследователи изучили нейропротекторные эффекты белков, кодируемых SARS-CoV-2, in vivo с использованием видов дрозофилы .

Для генетического анализа дрозофилы проводили культивирование мух и скрещивания, а вновь синтезированные белки личинок дрозофилы метили пуромицином (Pum), после чего анализировали продолжительность жизни мух. HeLa, трансфлуорную клеточную линию планшета (U2OS) и клетки эмбриональной почки человека (HEK) 293T использовали для экспериментов с клеточными культурами, и был проведен анализ лекарственной обработки, при котором клетки HeLa обрабатывали такими лекарственными средствами, как циклогексимид, гомохаррингтонин (HHT), Pum и эметин.

Кроме того, были проведены репортерные анализы остановки трансляции. Чтобы оценить потенциальную эффективность белков SARS-CoV-2 в отношении функции НМ, были экспрессированы 12 белков SARS-CoV-2, которые, вероятно, участвуют во внутриклеточных взаимодействиях вирус-хозяин, включая неструктурные белки (Nsp)-1,2,3. , 6, открытые рамки считывания (Orf)-3a, 3b, 6, 7a, 7b, 8, 9b и 10. Были проведены анализы положения крыльев и двигательной активности для оценки целостности мускулатуры непрямого полета и функции мышц, соответственно.

Команда исследовала, может ли экспрессия белка SARS-CoV-2 усугубить нарушенное функционирование НМ у пациентов с нейродегенеративными заболеваниями. Вестерн-блот-анализ и иммуноокрашивание были выполнены для подтверждения экспрессии белка SAR-CoV-2. Затем эффекты Nsp1 на фенотипы, связанные с болезнью Альцгеймера (AD), были исследованы в контексте полноразмерного белка-предшественника амилоида (FL-APP) и на APP- или APP.C99-индуцированные дефекты памяти и обучения.

Для поведенческих анализов использовали трансгенных мух, коэкспрессирующих β-секретазу и FL-APP в нейронах, и BACE1 (бета-секретаза 1) использовали для облегчения продукции APP.C99 из FL-APP. Кроме того, были изучены основные механизмы активности Nsp1 против патологий, вызванных APP.C99, и оценены эффекты Nsp1 на FL-APP. Синтез белка в тканях дрозофилы , основанный на включении Pum в формирующиеся пептидные цепи (NPC), был измерен для изучения эффектов Nsp1 на глобальную трансляцию.

Для оценки уровней матричной рибонуклеиновой кислоты (мРНК) был проведен количественный анализ полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (qRT-PCR). Клетки млекопитающих использовали для исследования механизмов регуляции остановленной трансляции, опосредованных Nsp1, для чего остановившиеся NPC были помечены Pum и обработаны комбинациями Pum-эметин. Эффекты Nsp1 на остановку рибосомы оценивали с помощью зеленого флуоресцентного белка (GFP) -P2A-K20-P2A-red. репортерных анализов флуоресцентного белка (RFP) и путем оценки влияния Nsp1 на индикатор столкновения рибосом субъединицы 40S Rps3 (рибосомный белок s3).

Команда исследовала потенциальную значимость передачи сигналов циклической GMP-AMP-синтазы, индуцированной столкновением рибосом, и стимулятора генов интерферона (cGAS / STING) среди токсичности NM клеток APP.C99. Кроме того, был проведен поиск опубликованной литературы о взаимодействиях факторов, связанных с Nsp1 и RQC, чтобы понять механизмы регуляции остановки рибосомы Nsp1. Рибосомный анализ в градиенте сахарозы был проведен для изучения распределения субъединицы 3 комплекса активирующего сигнального коинтегратора 1 (ASCC3) и фактора 1, связанного с дифференцировкой эндотелия (EDF1).

Полученные результаты

Сверхэкспрессия Nsp1 эффективно восстанавливала поведенческие фенотипы и дегенерацию NM среди видов Drosophila , моделирующих болезнь Паркинсона, боковой склероз амиотрофического типа и AD. Механизм аберрантного накопления белка из-за столкновения и остановки трансляционных рибосом (и, как следствие, нарушения протеостаза) был общим для всех трех заболеваний.

Nsp1 продемонстрировал многостороннее действие в разрешении столкнувшихся рибосом, прерывании остановленных трансляций и удалении дефектных продуктов трансляции, вызывающих смоделированные заболевания, по крайней мере, частично посредством ABCE1, факторов контроля качества, связанных с рибосомами, передачи сигналов AKT и аутофагии. Эффекты Nsp1 были исключительно специфичными, и он спасал связанную с AD недостаточность протеостаза и дегенерацию NM у трансгенных мух с С-концевым фрагментом APP (APP.C99).

Nsp1 способствовал удалению аберрантных видов APP.C99 в результате неадекватного контроля качества рибосом-ассоциированного белка (RQC) остановки рибосомы. Nsp1 не вызывал глобального прекращения синтеза белка или оборота мРНК APP.C99 у Drosophila . Nsp1 способствует разрешению столкновений рибосом и ингибирует путь cGAS/STING. ABCE1 (член 1 подсемейства E АТФ-связывающей кассеты) опосредовал эффекты Nsp1 на остановленную трансляцию APP.C99.

Влияние Nsp1 на экспрессию APP/APP.C99 маловероятно из-за деградации мРНК или глобального ингибирования трансляции. Для Nsp1 не наблюдалось влияния на отношение RFP/GFP, выраженное репортером без остановки, GFP-P2A-K0-RFP, для Nsp1; однако, используя репортер остановки трансляции GFP-P2A-Flag-K20-P2A-mKate2, Nsp1 снижал соотношение mKate2/GFP.

При коронавирусной болезни 2019 (COVID-19) Nsp1, вероятно, способствует разборке остановившейся рибосомы на РНК SARS-CoV-2, чтобы предотвратить накопление аберрантного вирусного белка, или рециркуляции рибосом, которые остановились на мРНК хозяина, чтобы повысить их доступность для трансляции SARS-CoV-2. . Индуцированное Nsp1 снижение общего уровня APP.C99 и FL-APP согласуется с режимами абортивного прекращения действия Nsp1 на застопорившихся рибосомных молекулах.

Вывод

В целом, результаты исследования показали улучшение дегенерации НМ с помощью Nsp1 в нескольких моделях нейродегенеративных заболеваний и предоставили новое представление о биохимических функциях Nsp1 при манипулировании механизмом трансляции хозяина. Полученные данные выявили новый механизм Nsp1 в манипулировании трансляцией хозяина для борьбы с возрастными нейрогенеративными заболеваниями.