В недавнем исследовании, опубликованном на сервере препринтов bioRxiv *, исследователи изучили кристаллическую структуру вируса оспы обезьян (MPX) (MPXV) и комплекс VP39, 2′-O-РНК-метилтрансферазы (MTase) и синефунгина, пан- Ингибитор МТазы.

Число случаев MPX растет с каждым часом по всему миру и может указывать на новую пандемию. Структурный анализ MPXV может помочь в разработке эффективных противовирусных средств для борьбы с MPXV. Поксвирусы кодируют ферменты декапирования для предотвращения накопления двухцепочечной рибонуклеиновой кислоты (дцРНК) во время инфекции, что может вызвать врожденный противовирусный иммунный ответ. MPXV кодирует фермент поксин, который ингибирует путь cGAS-STING (циклическая GMP-AMP-синтаза-стимулятор генов интерферона), запускаемый дц-дезоксирибонуклеиновой кислотой (дцДНК).

Задокументировано метилирование начального нуклеотида (nt) зрелого кэпа MPXV (или кэп-1) в положении 2′-O рибозы. МТаза требуется семейству вирусов Poxviridiae (включая MPXV) для синтеза кэп-0, и путем добавления еще одной метильной группы в 2′-O-положении проксимальной рибозы незрелый кэп (кэп-0) может быть преобразован в зрелый. крышка. Этот этап необходим для предотвращения развития врожденных иммунных ответов и катализируется VP39, 2′-O-MTase MPXV.

Об исследовании

В настоящем исследовании исследователи оценили структуру комплекса VP39-синефунгин MPXV, чтобы улучшить понимание механизмов ингибирования молекулы VP39 синефунгином. Они также сравнили структуру с 2′-O МТазами вирусов с одноцепочечной РНК (оцРНК), таких как вирус Зика и коронавирус тяжелого острого респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2).

Ген VP39 штамма MPXV USA-May22 был оптимизирован по кодонам для экспрессии в E. coli для последующего синтеза и клонирования. Клетки E. coli BL21 конвертировали экспрессирующей VP39 плазмидой и добавляли IPTG (изопропил-bD-тиогалактопиранозид), после чего рекомбинантный VP39 очищали. Клетки центрифугировали, лизировали, лизат подвергали хроматографическому анализу. VP39 концентрировали и смешивали с синефунгином для испытаний на основе кристаллизации.

Первоначально образовавшиеся кристаллы измельчали, а затравочные скрининги и РНК-субстраты готовили путем транскрипции in vitro . Впоследствии были проведены анализы 2′-O-MTase и анализы эхо-масс-спектрометрии. Определяли скорость активности МТазы, ингибирование 2´-O-МТазы синефунгином и скорость превращения субстрата (SAM), а также определяли значения полумаксимальной ингибирующей концентрации (IC 50 ).

Gaia Herbs, Гриб рейши, 40 веганских капсул

Кристаллографический набор данных полученных дифракционных кристаллов был проанализирован. Структурные характеристики комплекса VP39/синефунгин изучали методом молекулярного замещения, используя в качестве поисковой модели структуру комплекса вируса коровьей оспы VP39/САК. Для проверки ферментативной активности рекомбинантного VP39 тестировали два субстрата с разными предпоследними основаниями (m7GpppA-РНК и m7GpppG-РНК).

Взаимодействия VP39-синефунгин анализировали путем создания модели комплекса синефунгин:РНК:VP39 для иллюстрации молекулярных механизмов, лежащих в основе ингибирования VP39 синефунгином. Кроме того, каталитические сайты VP39 сравнивали с сайтами 2′-O-рибозных МТаз из отдаленных вирусов Зика и SARS-CoV-2.

Полученные результаты

Структура MPX включала складку Россмана, напоминающую складку альфа/бета (α/β), с расположенным в центре β-слоем, состоящим из β2-β10 в образце, напоминающем букву J. Примечательно, что закономерность была также обнаружена для неструктурного белка 2′-O-MTase (nsp) 1614 SARS-CoV-2. Центральный β-лист был закреплен на месте с одного конца спиралями альфа-1, альфа2, альфа-6 и альфа-7 и спиралями альфа-3 и альфа-7 на другом конце, а стороны были соединены β1, β11 и α5.

Оба субстрата РНК оказались приемлемыми; однако предпочтительным был вариант с предпоследним основанием гуанина. Синефунгин ингибировал VP39 со значением IC 50 41 мкМ. Было обнаружено, что синефунгин занимает SAM-карман с его адениновым основанием, расположенным в глубоко расположенном каньоне, выстланном боковыми цепями гидрофобного типа остатков Val116, Phe115, Leu159 и Val139 с водородной связью. Синефунгин эффективно защищал 2′-O-рибозную область своими аминогруппами вблизи 2′-рибозной области, где в противном случае находился бы атом серы SAM.

У каньона SAM было два конца, из которых один конец, граничащий с карманом РНК, был жизненно важен для позиционирования SAM для реакций метилтрансферазы, а противоположный конец, расположенный рядом с адениновым основанием синефунгина, был свободен. При ближайшем рассмотрении в этом месте была обнаружена сложная сеть молекул воды, соединенных водородными связями и связанных с остатками Glu118, Asn156 и Val116, а также фрагментом аденина.  

Молекулы на основе каркаса синефунгина, несущие фрагменты, которые могут замещать молекулы воды и непосредственно взаимодействовать с остатками Glu118, Asn156 и Val116, могут быть исключительно хорошими связующими, поскольку замещение молекул воды может вызывать благоприятные энтропийные эффекты. Сходство сайтов связывания MPXV SAM с Зика и SARS-CoV-2 было поразительным. Идентичные конформации наблюдались среди синефунгина и белков NS5, nsp16 и VP39 вируса Зика, SARS-CoV-2 и MPXV соответственно.

Каталитическая тетрада остатков (Asp138, Lys41, Glu218 и Lys175) для MPXV была консервативной среди трех протестированных отдаленных вирусов, включая конформации остатков. Кроме того, все вирусы использовали остаток аспартата для взаимодействия с аминогруппой синефунгина. Сохраняющиеся режимы связывания среди трех вирусов показали, что один ингибитор МТазы может быть потенциально использован в качестве пан-противовирусного агента. Однако наблюдались различия в способах связывания азотистых оснований и рибозных колец.

В целом, результаты исследования показали, что ингибиторы на основе МТазы могут быть мишенями для всех противовирусных препаратов.

*Важное замечание

bioRxiv публикует предварительные научные отчеты, которые не рецензируются экспертами и, следовательно, не должны рассматриваться как окончательные, направляющие клиническую практику/поведение, связанное со здоровьем, или рассматриваться как установленная информация.