В недавнем исследовании Nature Nanotechnology исследователи описывают различные применения технологии на основе нанопор, помимо секвенирования дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК). В частности, текущие исследования сосредоточены на достижениях этой технологии в области химии, биофизики и нанонауки.

Исследование:  технологии на основе нанопор, выходящие за рамки секвенирования ДНК. Изображение предоставлено: Юрчанка Сергей / Shutterstock.com

Что такое нанопоры?

В обычном применении интересующие аналиты будут поступать в нанопору под действием приложенного тока, который изменяет поток ионов через нанопору. Это изменение в ионном потоке отражается в виде зависящей от времени записи тока, которую можно использовать для обнаружения и характеристики различных биомолекул, таких как ДНК, РНК, белки, пептиды, метаболиты и комплексы белок-ДНК на молекулярном уровне.

Тип нанопор, используемых для данного исследования, зависит от интересующего аналита, поскольку размеры нанопоры и аналита должны быть сопоставимы, чтобы произвести регистрируемое изменение ионного тока.

Биологические нанопоры, например, могут распознавать биомолекулы с диаметром в диапазоне от -1 до 10 нанометров (нм). Для сравнения, твердотельные нанопоры используются для оптических приложений, включая электронно-ионный миллион, лазерное оптическое травление и диэлектрический пробой сверхтонких твердых мембран.

Применение нанопор

Хотя нанопоры изначально были разработаны для обнаружения ионов и малых молекул, в частности, для целей секвенирования ДНК, применение этой технологии значительно расширилось.

Некоторые из ключевых преимуществ нанопор, которые способствовали их широкому применению, включают их способность захватывать одиночные молекулы последовательно и с высокой скоростью, преобразовывать как структурные, так и химические свойства аналитов в измеримый ионный ток и идентифицировать свободные от меток частицы для усиление сигнала.

Однобелковый структурный анализ и секвенирование

Твердотельные нанопоры могут помочь выделить общие свойства белков, такие как объем, диполь и форма. Кроме того, лиганды, такие как биотин, аптамеры, белковые домены или антитела, могут напрямую присоединяться к биологическим нанопорам даже в присутствии сложных сред, таких как сыворотка.

Помимо идентификации белков, нанопоры могут выступать в качестве одномолекулярных сенсоров для предоставления информации об активности, динамике и конформационных изменениях белков. Например, захватывая белок внутри биологической нанопоры, исследователи могут получить информацию о конформационных изменениях и динамике белка, когда он остается внутри нанопоры.

Хотя нанопоры не могут предоставить информацию об активности отдельных ферментов, они могут быть в состоянии контролировать образование продуктов после ферментативных реакций, в основном, когда обычные спектроскопические анализы недоступны.

Одномолекулярная химия

Биологические нанопоры, спроектированные таким образом, чтобы содержать реактивные центры, называются белковыми нанореакторами. Эти специфические нанопоры могут помочь в анализе процессов образования и разрыва связей отдельных молекул, прикрепленных к внутренней стенке нанопоры, поскольку она модулирует ионный ток. Дополнительные применения нанореакторов включают анализ фитохимии, стереохимических превращений, стадий полимеризации и первичного изотопного эффекта.

Нанопоры для изучения биологических процессов

Клетки имеют несколько пор размером в несколько нанометров в своих мембранах, которые действуют как ворота для молекулярного транспорта между клеточными компартментами. Чтобы лучше понять механизмы, участвующие в транспорте биомолекул через эти поры, их можно извлечь из клетки и закрепить внутри плоских липидных мембран. К сожалению, этот подход к восстановлению чрезвычайно сложен; таким образом, нанопоры открывают захватывающие возможности для изучения клеточной биологии.

Различные инженерные системы на основе нанопор могут имитировать биологические поры in vitro, такие как асимметричные твердотельные нанопоры, которые могут имитировать переключаемые ионные каналы для изучения ионных насосов и пор, управляемых ионами и pH. Кроме того, синтетические поры ДНК-оригами также можно использовать для имитации управляемых лигандом ионных каналов, тогда как биологические нанопоры можно сконструировать для имитации пассивных или активных мембранных переносчиков.

Комплекс ядерных пор (NPC), более крупные поры, которые регулируют транспортировку белков и РНК между клеточными компартментами, также можно изучать с помощью биомиметических NPC. Хотя имеется значительный объем информации о биологической функции NPC, биомиметические NPC можно использовать для лучшего понимания специфических транспортных свойств этих биологических пор.

Идентификация и количественная оценка биомаркеров

Анализ наличия специфических биомаркеров в биомедицинских образцах, таких как биологические жидкости, биоптаты тканей или другие биологические образцы, такие как вирусы, бактерии и клеточные культуры, связан с многочисленными проблемами.

Например, биомолекулы-мишени в образцах, многие из которых представляют собой нуклеиновые кислоты или белки, могут присутствовать в диапазоне концентраций от десятков аттомолярных (10–18 М  ) до субнаномолярных (10–9 М  ). Кроме того, такие клинические образцы также содержат различные другие биомолекулы, которые могут мешать работе самого датчика с нанопорами.

Чтобы преодолеть эти ограничения, для анализа клинических образцов были разработаны различные интеллектуальные биоанализы и устройства, использующие технологию обнаружения нанопор. Например, новые микрожидкостные устройства, интегрированные с датчиками нанопор, потенциально могут использоваться для подготовки проб или определения уровней концентрации аналита.

Кроме того, специфические биохимические анализы, основанные на биологических нанопорах, могут повысить молекулярную специфичность, одновременно устраняя нежелательные взаимодействия с фоновыми молекулами. Этот подход также может уменьшить потерю молекул-мишеней во время подготовки образца, гарантируя при этом, что нанопора защищена от любой потенциальной деградации из-за окружающих биомолекул.

Выводы

Благодаря усовершенствованию конструкции нанопор эти технологии будут продолжать развиваться и решать научные задачи. Более того, исследователи ожидают, что нанопоры найдут новое применение в самых разных областях, от молекулярного зондирования и секвенирования до химического катализа и биофизической характеристики.