В недавнем исследовании, опубликованном на сервере препринтов bioRxiv * , исследователи обсуждают надежный метод выявления мутаций, которые одновременно улучшают экспрессию и стабилизируют конформацию до слияния гликопротеина спайка (S) коронавируса тяжелого острого респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2). .

Исследование:  высокопроизводительная идентификация мутаций, стабилизирующих префузию, в шипе SARS-CoV-2. Изображение предоставлено: Санджая Вирадж Бандара / Shutterstock.com

Фон

Для большинства вакцин против коронавирусной болезни 2019 (COVID-19) в качестве иммуногена для повышения эффективности против этого вируса требуется предварительно стабилизированный S-белок SARS-CoV-2. Мутации K986P и V987P S, например, стабилизируют его предварительно слитую конформацию.

Все методы, которые в настоящее время используются для конструирования вакцинных иммуногенов, стабилизированных до слияния, включают утомительную экспериментальную работу и полагаются на структурную информацию. Структурное определение и последующая экспрессия, очистка и характеристика каждой S-мутации трудоемки, что затрудняет их быструю идентификацию.

Предыдущие исследования показали, что несколько других мутаций также могут улучшить экспрессию S SARS-CoV-2. Например, было показано, что конструкция S, известная как HexaPro, содержащая мутации F817P, A892P, A899P и A942P, в дополнение к K986P и V987P, подтверждает экспрессию S.

Об исследовании

В настоящем исследовании исследователи описывают новый высокопроизводительный подход к параллельному измерению фузогенности множества S-мутаций SARS-CoV-2, которые потенциально могут стабилизировать его конформацию до слияния, не полагаясь на структурную информацию.

Этот метод сочетает в себе анализ слияния на основе флуоресценции, технологию отображения клеток млекопитающих и глубокое мутационное сканирование (DMS). Более того, он нацелен на конформационную перестройку в домене S2, который охватывает первый гептадный повтор (HR1), состоящий из 912–984, и центральную спираль (СН) из остатков 985–1034.

Исследователи создали библиотеку DMS, состоящую из аминокислотных мутаций от остатков 883 до 1034 мембраносвязанного белка S, и использовали ее для кодирования и экспрессии одного мутанта S в клетке посадочной площадки HEK293T. Все S-экспрессирующие клетки также экспрессировали mNeonGreen211 (mNG211) и были названы S-экспрессирующими клетками.

Также была разработана стабильная клеточная линия, которая экспрессирует человеческий ангиотензинпревращающий фермент 2 (hACE2) и mNG21-10, которые были названы hACE2-экспрессирующими клетками.

Экспрессия мембраносвязанного S в 122 клетках посадочной площадки HEK293T и образование зелено-флуоресцентных синцитиев за счет слияния обоих типов клеток была подтверждена с помощью проточной цитометрии (FC). Анализ слияния был оптимизирован для максимального образования зелено-флуоресцентных синцитиев при минимальном риске засорения сортировщика клеток.

Были получены оценки слияния и экспрессии для каждой из 2736 миссенс-мутаций, 152 нонсенс-мутаций и 152 молчащих мутаций в S-белке. В то время как более высокая оценка экспрессии указывала на более высокую экспрессию S, более высокая оценка слияния указывала на большую фузогенность белка S. Показатели экспрессии и слияния были нормализованы таким образом, чтобы средний показатель молчащих мутаций и бессмысленных мутаций был равен единице и нулю соответственно.

Для анализа экспрессии и слияния использовали соответственно три и два биологических повтора. Также была получена скорректированная оценка слияния, которая представляла собой остаток линейной регрессионной модели оценки слияния по оценке экспрессии.

Наконец, исследователи объединили проверенные некомпетентные мутации K986P, V987P, D994Q 181 и Q1005R для создания двойных, тройных и четверных мутантов мембраносвязанного или полноразмерного S-белка. 

Результаты исследования

За исключением F817P, все другие мутации в HexaPro, присутствующие в библиотеке DMS, подвергались скринингу. Данные DMS последовательно показали, что A899P оказывал минимальное влияние на экспрессию S, тогда как A892P и A942P заметно повышали его экспрессию.

Solgar, пиколинат цинка, 100 таблеток

Измерение экспрессии белка и фузогенности S-мутаций SARS-CoV-2 с использованием глубокого мутационного сканирования. а, Схема высокопроизводительных анализов экспрессии и слияния для мутантов S. b, проточный цитометрический анализ экспрессии белка S в клетках посадочной площадки HEK293T, которые кодируют S WT или библиотеку DMS. c, флуоресцентные микрофотографии совместного культивирования S-экспрессирующих клеток с hACE2-экспрессирующими клетками. Масштабная линейка: 100 мкм. d, проточный цитометрический анализ активности слияния при совместном культивировании клеток, экспрессирующих hACE2, с клетками посадочной площадки HEK293T, кодирующими WT S или библиотеку DMS. Компоненты расщепленного mNG2 указаны там, где они присутствуют.

Среди биологических повторов коэффициент корреляции Пирсона оценок экспрессии колебался от 0,72 до 0,79, тогда как коэффициент слияния составлял 0,61, что подтверждает воспроизводимость экспериментов DMS.

Распределение показателей экспрессии и слияния молчащих мутаций значительно отличалось от такового для нонсенс-мутаций, что указывает на то, что эксперименты с DMS могут различать мутанты с разными уровнями экспрессии и фузогенности.

Оценки экспрессии и слияния отдельных мутаций в библиотеке DMS. а, показан  график оценки слияния в зависимости от оценки экспрессии для каждого мутанта. WT обозначен розовым цветом. Мутации, используемые в HexaPro 24  , отмечены желтым цветом. Репрезентативные мутации, не отвечающие за слияние, выявленные в этом исследовании, выделены фиолетовым цветом (не фузогенные). Репрезентативные мутации, которые усиливают фузогенность S, выделены красным цветом (фузогенные). Мутации, обнаруженные в основных вариантах SARS-CoV-2 ( таблица расширенных данных 1 ), отмечены бирюзовым цветом (варианты). Каждая точка данных представляет одну мутацию в библиотеке DMS. Отдельные точки данных имеют размер в соответствии со средней частотой соответствующих мутаций. б, Показан график скорректированной оценки слияния в зависимости от оценки экспрессии для каждого мутанта. Коэффициент корреляции Пирсона,  r , показан на  a, b . c,  Места некомпетентных к слиянию мутаций обозначены голубыми сферами. Области, которые мутировали в библиотеке DMS, окрашены в пшеничный, зеленый и розовый цвета для каждого мономера. 

Анализ слияния измерял фузогенность на клеточном уровне, а не на уровне отдельных молекул. Более того, оценка слияния положительно и последовательно коррелирует с оценкой экспрессии.

Мутации с низкой скорректированной оценкой слияния и высокой оценкой экспрессии включали K986P и V987P, обе из которых используются в современных вакцинах против COVID-19, что демонстрирует, что метод исследования может выявлять мутации, стабилизирующие предслияние.

В дополнение к K986P и V987P метод исследования выявил другие мутации в HR1 и CH, которые имели низкие скорректированные показатели слияния и высокие показатели экспрессии, включая T961F, D994E, D994Q и Q1005R. Примечательно, что D994E и D994Q сгруппированы в одних и тех же положениях аминокислотных остатков и были химически сходны.

В соответствии с данными DMS эффекты T961F, D994E, D994Q и Q1005R на экспрессию S и фузогенность были сравнимы с K986P и V987P в проверочных экспериментах.

Валидация кандидатных мутаций, стабилизирующих префузию.ac, Экспрессия мутаций, стабилизирующих префузию (a), мутаций, усиливающих слияние (b), и комбинаций мутаций-кандидатов, стабилизирующих префузию, S (c) относительно WT. Следует отметить, что числовые значения кратности изменения средней интенсивности флуоресценции (MFI) указывают на относительную, а не абсолютную кратность изменений в уровнях поверхностной экспрессии S. df, кратность изменения активности слияния кандидатов в мутации, стабилизирующие префузию (d), усиливающие слияние мутации (e) и комбинации потенциальных стабилизирующих префузию мутаций S (f) относительно WT через 3 часа после смешивания с клетками, экспрессирующими hACE2. Сокращения для комбинаторных мутаций следующие: 2P, K986P/V987P; 2ПК, К986П/В987П/Д994К; 2ПР, К986П/В987П/К1005Р; 2PQR, K986P/V987P/D994Q/Q1005R. Изменения кратности показаны как среднее значение ± диапазон. Данные взяты из n = 2 независимых повторов.

Множественные мутации HR1 и CH, в том числе обнаруженные в вариантах SARS-CoV-2, не оказывали негативного влияния на экспрессию или фузогенность белка S. HR1 и CH были связаны с высокой степенью эволюционной консервативности среди бета-коронавирусов.

Большинство нейтрализующих антител против SARS-CoV-2 нацелены на область рецептор-связывающего домена (RBD) S-белка; следовательно, HR1 и CH могут находиться под низким давлением отбора. Др. объяснение этого наблюдения заключается в том, что др. эволюционные ограничения на HR1 и CH могут присутствовать in vivo .

Хотя выше, чем у белка S дикого типа, поверхностная экспрессия комбинаций мутаций S была сопоставимой. Ни одна из этих комбинаций мутаций S не сливалась с клетками, экспрессирующими hACE2.

Эксклюзионная хроматография (SEC) всех мутантов показала, что мутация Q1005R, вероятно, увеличивала образование олигомеров более высокого порядка растворимого эктодомена S. Таким образом, специфические мутации S могут улучшать экспрессию S в мембраносвязанной форме, но не в форме растворимого эктодомена.

Выводы

Учитывая, что предварительная стабилизация белка S имеет решающее значение для разработки вирусного иммуногена, результаты исследования имеют большое значение для разработки вакцины против COVID-19. Кроме того, результаты показывают, что эволюционные ограничения S2 имеют отношение к антигенному дрейфу SARS-CoV-2 и разработке универсальных вакцин против коронавируса.

Тем не менее, в будущих исследованиях следует продолжить изучение взаимосвязи между экспрессией S-белка, фузогенностью и приспособленностью к репликации SARS-CoV-2, чтобы определить биофизические процессы, которые способствуют эволюции SARS-CoV-2.

О мутациях белков S бета-коронавируса, стабилизирующих префузию, впервые сообщили в 2010 году, задолго до начала пандемии COVID-19. Это помогло ускорить разработку вакцин против COVID-19 в дополнение к достижениям в технологии вакцин с мессенджером на основе рибонуклеиновой кислоты.

Следующая пандемия может быть вызвана вирусом, для которого отсутствует такая информация. Таким образом, крайне важно максимизировать скорость разработки вакцинных иммуногенов для ускорения технологии разработки вакцин для еще не появившихся вирусов, которые могут вызывать пандемии.

*Важное замечание

bioRxiv публикует предварительные научные отчеты, которые не рецензируются экспертами и, следовательно, не должны рассматриваться как окончательные, направляющие клиническую практику/поведение, связанное со здоровьем, или рассматриваться как установленная информация.