В недавнем исследовании, опубликованном в bioRxiv *, исследователи из США продемонстрировали, что основная протеаза (M pro ) коронавирусов (CoV) активирует воспалительные реакции хозяина.

Иммунитет, запускаемый эффекторами (ETI), представляет собой защитную стратегию хозяев, при которой врожденные сенсоры распознают патогены, а подмножество сенсоров ETI у эукариот образуют инфламмасомы. Инфламмасомы представляют собой большие иммунные комплексы внутри клеток, которые активируют провоспалительные каспазы, в основном каспазу 1 (CASP1), для запуска передачи сигналов воспаления и пироптотической гибели клеток.

У людей датчики, формирующие инфламмасомы, такие как член семейства доменов рекрутирования каспаз 8 (CARD8), обнаруживают активность вирусных протеаз. CARD8 содержит неупорядоченный N-конец и С-концевой домен поиска функции (FIIND) и CARD. Саморасщепление FIIND приводит к образованию двудольного сенсора, где N-конец действует как растяжка для вирусных протеаз.

Исследование: специфичное для хозяина определение коронавирусов и пикорнавирусов инфламмасомой CARD8 . Изображение предоставлено: Катерина Кон / Shutterstock

Исследование и выводы

В настоящем исследовании исследователи оценили распознавание вирусных протеаз инфламмасомой CARD8. Используя ранее описанный биоинформационный подход, авторы создали прогностическую модель для M pro [также известной как 3-химотрипсин-подобная протеаза (3CL pro )] CoV. Они идентифицировали два предполагаемых сайта расщепления M pro на N-конце CARD8 человека. Изоформа CARD8 коэкспрессировалась с M pro тяжелого острого респираторного синдрома (SARS)-CoV-2.

Продукт CARD8 массой 34 кДа был обнаружен в присутствии M pro SARS-CoV-2 , который, по прогнозам, является результатом расщепления в Q37. Сайт расщепления подтверждали путем мутации остатка в этом сайте (до Q37A), что устраняло продукт массой 34 кДа после обработки M pro . Интересно, что мутант Q37A продуцирует загадочный M pro -зависимый продукт массой 37 кДа в результате расщепления Q61. Более того, мутант Q37A Q61A CARD8 был нечувствителен к расщеплению SARS-CoV-2 M pro .

Solgar, пиколинат цинка, 100 таблеток

Трансфекция клеток HEK293T с помощью CASP1, проинтерлейкина-1-бета (про-ИЛ-1β) и M pro приводила к надежному процессингу про-ИЛ-1β в активный ИЛ-1 . Активация воспаления не происходила в клетках с нокаутом CARD8 (KO). Кроме того, клетки CARD8 KO были дополнены CARD8 дикого типа или мутантами по сайту расщепления. Комплементация CARD8 дикого типа восстанавливала M pro -индуцированную активацию воспаления. Напротив , M pro -индуцированная активация воспаления была снижена (с мутантом Q37A) или устранена (с мутантом Q37A Q61A) в клетках CARD8 KO.

Кроме того, они проверили, расщепляют ли протеазы других соответствующих CoV CARD8. С этой целью они клонировали M pro из других CoV, таких как CoV человека (HCoV)-229E, HCoV-NL63, HCoV-HKU1, SARS-CoV, ближневосточного респираторного синдрома (MERS)-CoV и вируса гепатита мышей (MHV). ). Все протестированные протеазы расщепляли и активировали CARD8 сайт-специфическим образом. Кроме того, клеточную линию THP-1 инфицировали HCoV-229E для оценки последствий активации инфламмасомы CARD8.

Инфекция HCoV-229E в значительной степени приводила к высвобождению IL-1β и гибели клеток дикого типа, но не клеток CARD8 KO. Клеточная линия дикого типа или CARD8 -KO THP-1 была сконструирована для экспрессии ангиотензинпревращающего фермента 2 (ACE2) и трансмембранной протеазы серина 2 ( TMPRSS2 ) и инфицирована SARS-CoV-2. Гибель клеток и высвобождение IL-1β были очевидны в клетках дикого типа, экспрессирующих ACE2 и TMPRSS2, но не в клетках KO.

Затем исследовательская группа исследовала, служит ли инфламмасома CARD8 сенсором M pro у Rousettus aegyptiacus (вид мегалетучих мышей). В megabat CARD8 отсутствуют Q37 и Q61, и он не расщепляется M pro SARS-CoV-2. Сайт про -расщепления TEV был вставлен в N-конец CARD8 мегабата, чтобы определить, может ли функциональная деградация активировать его. Расщепление TEV pro сконструированного CARD8 приводило к активации воспаления. Дальнейшие исследования показали, что M pro SARS-CoV-2 не активируется и вместо этого противодействует опосредованной TEV активации CARD8 летучих мышей . Точно так же все другие M профи помешали TEV proопосредованная активация инфламмасомы CARD8 летучих мышей.

Исследователи проанализировали несинонимичные однонуклеотидные полиморфизмы (SNP) в CARD8 в человеческой популяции. Они обнаружили несколько высокочастотных SNP, в том числе вариант S39P, находящийся в положении P2′ в сайте протеолитического расщепления, который присутствовал более чем в 20% африканских и афроамериканских образцов. Вариант CARD8 P39 показал сниженную чувствительность к расщеплению и активации CoV Mpros. 

Наконец, команда исследовала, влияет ли вариант CARD8 P39 на распознавание других патогенов. Пролин P2′ в сайте расщепления был предпочтительным для модели предсказания протеазы энтеровируса 3C (3C pro ). Анализы расщепления с помощью 3C pro  из риновируса человека (HRV), пикорнавируса, показали, что расщепление CARD8 в Q37 было более выраженным для варианта P39. Более того, активация воспаления с помощью HRV 3C pro  почти отсутствовала в клетках HEK293T CARD8 KO , дополненных CARD8 S39, но устойчива при дополнении CARD8 P39. Команда также заметила, что вариации CARD8 влияют на расщепление 3C pro  от других пикорнавирусов.

Выводы

В целом, исследование продемонстрировало, что CARD8 является полиморфным, быстро развивающимся врожденным иммунным сенсором инфекции РНК-вирусами с положительным смыслом. Тот факт, что инфекция SARS-CoV-2 вызывает активацию инфламмасомы CARD8 в клетках THP-1, подчеркивает роль инфламмасом в тяжелой коронавирусной болезни 2019 (COVID-19), предполагая, что инфламмасома CARD8 в макрофагах/моноцитах способствует воспалению у пациентов с COVID-19.

*Важное замечание

bioRxiv публикует предварительные научные отчеты, которые не рецензируются экспертами и, следовательно, не должны рассматриваться как окончательные, направляющие клиническую практику/поведение, связанное со здоровьем, или рассматриваться как установленная информация.