В недавнем исследовании, опубликованном на сервере препринтов medRxiv * , исследователи разработали высокопроизводительный, быстрый тест на обнаружение спайк-белка коронавируса тяжелого острого респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2) с использованием аллонамеров, нового типа аптамеров, которые выполняют аллостерическую регуляция вместо каталитической активности.

Фон

С началом пандемии коронавирусной болезни 2019 (COVID-19) появился стимул к разработке более эффективных и точных тестов для выявления SARS-CoV-2. До сих пор стандартным методом обнаружения был метод количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой (RT-qPCR), который обнаруживает рибонуклеиновую кислоту (РНК) SARS-CoV-2 в образцах мазков из дыхательных путей. Он требует обученного персонала и лабораторной установки для тестирования и может привести к ложноположительным и ложноотрицательным результатам из-за перекрестного связывания праймеров с неспецифическими областями и мутаций в областях-мишенях праймеров, соответственно.

Тесты на основе твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) нацелены на выработку антител иммуноглобулинов M (IgM) и G (IgG) вместо РНК SARS-CoV-2, но могут давать неточные результаты из-за недостаточных уровней IgM и IgG на ранних стадиях заболевания. инфекция. Это делает тесты на основе ELISA непригодными для раннего выявления SARS-CoV-2.

Экспресс-тесты для обнаружения антигенов (Ag-RDT) нацелены на вирусные шипы и белки нуклеокапсида в дыхательных путях и являются более подходящим вариантом для раннего выявления COVID-19. Однако их зависимость от высокоспецифичных моноклональных антител ограничивает их широкое применение.

Аптамеры нуклеиновых кислот с их высокой чувствительностью и аффинностью связывания могут сливаться с каталитической РНК или дезоксирибонуклеиновой кислотой (ДНК) с образованием рибопереключателей или дезоксирибопереключателей, которые можно использовать в качестве диагностического инструмента.

Об исследовании

В настоящем исследовании группа исследователей разработала новый класс аптамеров, известных как аллонамеры, которые представляют собой аллостерические повторы нуклеиновых кислот или мер, которые функционируют как рибопереключатели или дезоксирибопереключатели, но с аллостерической активностью вместо каталитического механизма. Аллонамеры использовались для создания высокопроизводительного экспресс-теста на антиген под названием Quantum-Logic Aptamer Analyte Detection (Q-LAAD) для обнаружения спайкового белка SARS-CoV-2.

NutriBiotic, Immunity, аскорбат натрия, кристаллический порошок, 454 г (16 унций)

Аллонамер ДНК был получен с использованием систематической эволюции лигандов путем экспоненциального обогащения (SELEX). Этот аллонамер состоял из двух связывающих доменов с линкерным участком. Связывание шиповидного белка SARS-CoV-2 с одним доменом приведет к конформационным изменениям в другом связывающем домене, что позволит ему соединиться с флуоресцентной репортерной молекулой.

Специфичность аллонамера к шиповидному белку SARS-CoV-2 и его способность связываться с шиповидными белками различных вариантов SARS-CoV-2 были проверены с помощью иммунофлуоресцентных анализов. Q-LAAD был подтвержден с использованием мазков из носа от потенциальных пациентов с COVID-19 с симптомами. Чувствительность и специфичность Q-LAAD сравнивали с таковыми метода RT-qPCR.

Полученные результаты

Результаты показали, что в анализах in vitro тест Q-LAAD на основе аллонамера может обнаруживать шиповидный белок SARS-CoV-2 в мазках из передней части носа. Чувствительность и специфичность составляли 97 % и 100 % соответственно, что намного превышало соответствующие минимальные требования к эффективности 80 % и 97 %, установленные Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) для рекомендуемого использования Ag-RDT.

Когда Q-LAAD тестировали против альфа-, бета-, гамма- и дельта-вариантов SARS-CoV-2, сигналы флуоресценции от обнаружения гамма- и дельта-спайковых белков были значительно выше, чем у контрольного нуклеокапсида, в то время как сигналы от связывания с альфа- и бета шиповидные белки показали пятикратное изменение, хотя оно не было значительным.

Анализ не давал перекрестной реакции ни на один из 28 распространенных респираторных патогенов или 19 эндогенных веществ, протестированных в исследовании. Однако другие вещества, такие как очищенный белок муцин, показали некоторую перекрестную реактивность при 0,5% веса к объему, что указывает на то, что чувствительность Q-LAAD может снизиться, если образцы мазков содержат большое количество слизи. Ингредиенты часто используемых препаратов для лечения инфекций верхних дыхательных путей также давали перекрестную реакцию на анализ.

Выводы

В заключение, исследование представило Q-LAAD, новый экспресс-тест на антиген на основе аллонамера, который показал высокую чувствительность и специфичность к очень низким уровням шиповидного белка SARS-CoV-2. Анализ Q-LAAD эффективно выявлял большинство вызывающих беспокойство вариантов SARS-CoV-2 и требовал небольших количеств легкодоступных реагентов .

Кроме того, авторы считают, что процесс SELEX позволяет легко модифицировать или обновлять аллонамеры для связывания с шиповидными белками будущих вариантов и другими мишенями, такими как нуклеокапсидные белки, для разработки многоцелевых анализов. Для анализа требуется только 96-луночный планшет и устройство для считывания флуоресцентных планшетов, что делает тест Q-LAAD эффективным по времени и стоимости.

По мнению авторов, Q-LAAD сочетает в себе чувствительность тестов на основе ПЦР и скорость и простоту тестов на антигены. Адаптивность, низкий предел обнаружения и экономичные возможности Q-LAAD с высокой пропускной способностью могут сделать его эффективным и динамичным инструментом для раннего обнаружения SARS-CoV-2.

*Важное замечание

medRxiv публикует предварительные научные отчеты, которые не рецензируются экспертами и, следовательно, не должны рассматриваться как окончательные, направляющие клиническую практику/поведение, связанное со здоровьем, или рассматриваться как установленная информация.